企鹅烟曲霉病的诊断

王玉田，朱华民2，金银姬，刘 鑫，李志衍,赵 有，潘兴亮，刘艳华，郑瑞峰

(1.北京市畜牧总站，北京朝阳100107 ； 2.北京市房山区琉璃河动物防疫站，北京房山102431，3.北京科为博生物科技有限公司，北京朝阳100850)

2017年2月, 某海洋馆已饲养17年的洪氏环企鹅死亡，从2016年8月发现换毛迟缓，逐渐消瘦。 2个星期前发现哮喘，呼吸困难。口服青霉素、链霉素等抗生素治疗无效，剖检腹腔、气囊、肺脏上有1～10 mm黄白色、干酪样结节。肿瘤、结核或是霉菌不能确定，来我单位诊断，希望确诊。

1 材料与方法

1.1 试验材料 剖开皮肤，机体消瘦，肺脏、气囊内有大小不等黄白色结节(见中插彩版图1、图2)，无菌采集肺脏上的增生结节组织。

1.2 试验方法

(1)病理组织血检验：增生结节10%福尔马林固定，经石蜡切片、H.E.染色、抗酸染色、PASM染色显微镜镜检。

(2)细菌病原检测：结节组织外部灼烧灭菌, 组织切面涂新鲜血液、巧克力琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基培养；镜检，观察细菌形态，多次分离纯化，得到纯化细菌(图3、图4)。取分离到真菌的DNA作为模板，用真菌菌种鉴定通用引物

(NS1 -GTAGTCATATGCTTGTCTC;NS6-GCAT

CACAGACCTGTTATTGCCTC )进行PCR 扩增，产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果提交GenBank，并与其他真菌进行比对，确定18S rDNA 基因型。

2 结果

2.1 病理组织学变化 病理性结节中心干酪性坏死，出现大量浪汉斯巨细胞，具有典型的感染性肉芽肿特征。H.E.染色发现无色透明的丝状菌丝结构，六胺银染色(PASM)方法染色可见黑褐色曲霉(图5)，呈典型的曲霉菌丝特征，菌丝细长有隔，粗细均匀，从结节中心向外周组织放射状排列(图6)；抗酸染色未见阳性分支杆菌。

2.2 细菌病原分离、鉴定 经多次分离培养，仅在马铃薯琼脂培养基上菌落生长块，棉花样，开始为白色，2～3 d转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状。根据真菌18S rDNA序列差异性分析，确定该菌株18S rDNA 序列(GenBank 登录号为 KR019681.1)为烟曲霉。

测序获得的基因序列：

TATACGGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATCCTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTG

TGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATG

CCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAAT

TTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG

ATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCG

ACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAA

ATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATA

TTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTG

GTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGA

AAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCT

ATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTG