结肠癌干细胞相关信号通路

赵 敏 张苏闽 卞尧尧 曾 莉 (南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 0046)

结肠癌(CRC)是全球第二常见的癌症类型，第四大癌症相关死亡原因〔1〕，其发病率和死亡率居高不下，严重影响人类生命健康。近数十年来，随着癌干细胞(CSCs)概念的提出和发展，对CSCs相关信号通路也进行了更深入的探索。2007年首次从CRC组织中分离出 CSCs，也是最早发现于消化道肿瘤中的CSCs〔2，3〕，是存在于肿瘤细胞中的一小部分具有自我更新、增殖、分化能力的细胞群，其特异性的表面标志物和异常活化的信号通路与结肠癌的发生、发展、复发、转移、低生存率和耐药性密切相关〔4〕，从而通过调控相关的表面标志物和信号通路成为靶向治疗肿瘤的关键。本文就影响CSCs的相关信号通路综述如下。

1 Wnt信号传导通路

Wnt信号通路是一类调节胚胎和组织发育过程中高度保守的通路，随着通路内越来越多的受体和共同受体被发现，形成了更高级配体-受体复合物向下游信号转导的错综复杂的受体网络〔5〕。目前Wnt信号传导主要有3个核心途径:Wnt/β-catenin信号，主要控制细胞增殖过程;Wnt/PCP(Planner Cell Polarity)信号，主要控制组织形态的发展过程;Wnt/Ca2+信号，主要控制细胞的运动改变。其中Wnt/β-catenin信号途径研究最多，是Wnt信号通路的经典通路，后两类信号途径由于技术难点，在组织稳态的生理功能还不甚了解，所以此部分主要针对Wnt/β-catenin信号通路的相关靶点进行综述。

在缺乏Wnt配体的情况下，β-catenin作为一种重要的转录共激活因子被蛋白酶降解去除和多蛋白破坏复合物磷酸化。当Wnt受体激活时，蛋白破坏复合体会被迅速抑制，β-catenin则会积累，随后移位到细胞核。在核内与T细胞因子(TCF)/淋巴样增强结合因子(LEF)家族转录因子协同驱动各种基因的表达，包括调节干细胞，细胞周期进程和细胞增殖。因此，转录因子β-catenin是调节Wnt通路的关键因素，Wnt/βcatenin传导是许多成年干细胞的标志，可以在许多分裂或再生组织中观察到〔6〕，该通路异常活化或通路中的任何因子过度表达都与肿瘤的发生发展密切，如乳腺癌、CRC等。所以通过抑制Wnt信号通路的传导来阻断癌细胞的分化对于CRC的治疗是非常有意义的。

Sui等〔7〕发现 β-catenin在血管内皮生长因子(VEGF)介导的肿瘤血管生成中起重要作用，丹参酮Ⅱ作为血管生成抑制剂能够抑制正常氧条件下的低氧诱导因子(TGF)-β1/β-catenin/TCF3/LEF1 信号通路及缺氧条件下的低氧诱导因子(HIF)-1α/β-catenin/TCF3/LEF1信号通路的激活。Monin等〔8〕将用于治疗绦虫感染的水杨酰胺衍生物氯硝柳胺(Niclosamide)作为抗CRC的治疗剂，发现其发挥的抑制作用与Wnt/β-catenin活性的降低有关，可能是由于氯硝柳胺破坏核β-catenin-Bcl9-LEF/TCF三联体的形成或者通过非经典Wnt/c-Jun氨基端激酶(JNK)途径的激活发挥抑制作用。

R-spondin(RSPO)家族是 Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白，RSPO2和RSPO3融合物在人类结肠肿瘤中与肠腺瘤性息肉蛋白(APC)和Catenin beta-1突变相互排斥，这表明RSPO的增加可以替代这些最常见的突变作为肠肿瘤发生的另一个驱动因素〔9〕。Hilkens等〔10〕证明RSPO3通过引起其扩增及促进包括Wnt/β-连环蛋白信号基因在内的相关基因的表达来刺激Lgr5+干细胞，Lgr4+细胞，Paneth细胞及其静止前体，促进肿瘤的快速生成。Storm等〔11〕显示在PTPRKRSPO3-融合阳性的人类异种移植肿瘤物中靶向RSPO3能够抑制肿瘤生长并促进分化。

LEF1属于 TCF/LEF转录因子家族，是 Wnt/βcatenin信号通路中一个非常重要的核转录因子〔12～14〕，并且在大肠肿瘤中表达明显高于其他转录因子，尤其是通过免疫组化技术检测时〔15〕。在没有Wnt信号传导的情况下，LEF1与Groucho相关的共抑制因子结合，从而负调节Wnt信号基因的表达〔16〕。当Wnt信号稳定后，β-catenin会取代与Groucho相关的共抑制因子，并且增强 LEF1转录因子活性〔17〕。LEF1与 βcatenin活性无关〔13〕，因此靶向LEF1将提供更直接的预防癌症增殖和转移的方法。Huang等〔18〕将 miR-219-5p作为一种肿瘤抑制因子阻断LEF1的表达，通过降低蛋白激酶B(AKT)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的激活抑制CRC的上皮细胞间质化(EMT)。

目前正在研究的大多数靶向治疗方法不仅会抑制肿瘤组织中的Wnt信号，也会破坏正常组织中的Wnt信号。因此，如何将正常组织与肿瘤组织分开，成为重要问题。有研究发现在APC失活引起的肠干细胞异常增殖过程中需要转录辅因子复合物Ebd-Ewg，与βcatenin-TCF共同合作以激活APC1失活后肠干细胞中Wnt靶基因的高水平转录，但在正常生理过程中，只有Ebd转录因子参与肠干细胞，而无Ewg转录因子〔19〕。

2 Notch信号传导通路

在哺乳动物中，Notch信号有4个 Notch受体(Notch1～4)和 5个 Notch配体(δ-like-1，-3和-4及Jagged1和2)。在与特异性配体结合之后，Notch受体的细胞内结构裂解并转位到细胞核，其结合转录因子重组结合蛋白免疫球蛋白κJ区域以激活Notch靶基因〔20〕。Notch信号通路激活后可能通过多种方式促进肿瘤扩散〔21〕，包括维持 CSCs自我更新〔22〕，直接涉及肿瘤侵袭的细胞过程(如EMT和乏氧应答)，控制血管新生及在转移微环境中发挥关键作用。

miR-34a作为肿瘤抑制因子是CRC早期分裂的细胞命运决定簇。Zhang等〔23〕发现miR-34a是通过靶向Notch信号通路来抑制CRC转移的。该课题组经过临床研究发现，miR-34a表达与肿瘤远处转移负相关，并与人类CRC的分化和生存率呈正相关;体外miRNA功能试验表明，在SW480细胞中，miR-34a与Notch1和Jagged1中假定的3＇-非翻译区联系，减弱了CRC迁移和入侵;另外，miR-34a通过Notch1和Jagged1降低了波形蛋白和纤连蛋白的表达。王园园等〔24〕人工干预miR-101在CRC细胞株HCT116中的表达，发现miR-101是靶向干扰Notch1的表达来发挥抑癌作用的。Xiao等〔25〕使用rDDK-1(Wnt信号通路抑制剂)和LY374973(Notch信号通路抑制剂)能够协同抑制HCT-116细胞系的增殖，迁移和G2/M百分比，并可进一步抑制移植肿瘤模型中肿瘤体积和重量。

3 TGF-β信号传导通路

TGF-β是人类最大的生长因子家族，包括超过30种相关配体，根据序列相似性条件主要分为TGF-β/Activin/Nodal亚家族通路和骨形态发生蛋白(BMP)亚家族通路，调节分化，迁移和凋亡等细胞行为的许多方面〔26〕。当这一信号通路上的成员出现突变，对肿瘤的发展和转移有促进作用〔27〕。

居颂文〔28〕检测CRC患者血浆外泌体表面mTGF-β1处于高表达状态，可能与CRC免疫抑制环境的构成相关，并促进 CRC的发生、发展。三基序蛋白(TRIM)25多在胃癌、女性生殖系统中异常表达，BMP-4在 CRC组织和细胞中表达普遍上调，Yokoyama等〔29〕研究发现通过BMPⅠ型受体抑制剂LDN-193189对内源性BMP信号传导的抑制，增加了CRC双特异性磷酸酶(DUSP)5的表达，通过Erk丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的去磷酸化诱导凋亡，减轻了CRC形成。Sun等〔30〕发现TRIM25也存在于CRC中，它激活了TGF-β信号传导途径，以促进肿瘤的扩散和转移，为治疗CRC提供了潜在靶点。

4 Hedgehog(Hh)信号传导通路

Hh信号通路对正常的胚胎发育、组织形成和细胞分化至关重要，其信号异常与多种癌症有关。Hh信号调控Gli代码，有些研究者认为Gli1和Gli2是CRC形成的主要分子开关〔31〕，也有研究者认为Gli3是关键分子开关〔32〕。人类CRC细胞中具有活化的Hh信号传导，由SHh配体和Gli1效应物转导，该信号对于表达干细胞标记物性别决定相关基因簇2，八聚体结合蛋白4和NANOG，EMT分化和肿瘤转移至关重要〔33〕，Hh信号在癌细胞的复制潜力是通过调节人类端粒酶逆转录酶(hTERT)来决定的〔34〕。

Hh信号传导在CRC肿瘤发生中的作用尚未完全阐明，Trnski等〔35〕又提供了该信号传导参与CRC细胞存活的有力证据，在人CRC组织样本中 GSK3β和Gli3的表达水平较高，GSK3β表达与DUKES分期呈正相关;在CRC细胞系中发现失调的GSK3β上调Hh-Gli信号并对CRC细胞存活有积极影响;氯化锂可以增强 Gli3-SuFu-GSK3β复合物形成，导致更有效的Gli3分裂和Hh-Gli信号下调，减少细胞增殖并诱导细胞死亡。Gerling等〔36〕研究结果表明，下游Hh信号减弱能够增强CRC发展，基质特异性Hh的活化可以作为CRC抑制剂降低肿瘤负荷并阻止晚期肿瘤进展。

5 核转录因子(NF)-κB信号传导通路

NF-κB家族成员通常以二聚体形式存在。在静止状态下，NF-κB与IκB结合形成异源多聚体，其位于无活性状态的细胞质中。随着NF-κB激活剂的刺激，IκB激酶(IKKs)被激活，导致三聚体磷酸化、IκB蛋白N末端泛素化和降解。因此，NF-κB二聚体被释放并通过翻译后修饰进一步活化。然后，NF-κB二聚体转位到细胞核中，与κB序列相互作用并调节转录。NF-κB通路调节免疫炎症反应，细胞存活和增殖，在CRC细胞生长、存活、入侵和迁移中起着非常关键的作用〔37〕。NF-κB 信号与肠 CSCs去分化相关。上调的NF-κB募集环磷腺苷效应元件结合蛋白(CBP)，并帮助CBP将RelA/p65与β-catenin结合，从而激活Wnt并诱导非癌干细胞去分化〔38〕。NF-κB信号参与诱导干细胞基因表达。IκB激酶2(IKK2ca)在肠上皮细胞中被组成型激活，并增加肠干细胞中干细胞样基因ASCL2，olfactomedin4(OLFM4)，Delta-like 1 同源物(DLK1)和 Bmi-1表达以促进肠道肿瘤发生〔39〕。IKK2ca表达的肠上皮细胞可以分泌细胞因子和趋化因子，诱导骨髓细胞并激活成纤维细胞，从而产生肿瘤微环境〔39〕。核基质结合因子(SAFB)在癌细胞入侵、转移和血管生成中发挥重要作用，它的异位表达抑制了CRC细胞的侵袭和转移。Jiao等〔40〕揭示了SAFB是通过靶向TAK1对NF-κB信号进行控制的，与TAK1和 NF-κB相关基因的表达呈负相关，表明 SAFBTAK1-NF-κB通路是早期治疗CRC的潜在目标。Su等〔41〕发现月苋草提取物三萜烯酸(螺旋酸、油酸和双丙酸)可能被认为是治疗CRC的潜在治疗剂，它们能够减少炎症、抑制细胞增殖和促进HT-29细胞的凋亡，通过在 NF-κB和信号传导及转录激活因子(STAT)3途径上的作用，获得了抗CRC效应。

6 表皮生长因子受体(EGFR)信号转导通路

表皮生长因子(EGF)信号对于CRC干细胞的出现和维持是至关重要的。当EGF、TGFα等配体与EGFR结合后，促进干细胞相关分子Notch、HH、Oct3/4和Wnt的表达。EGFR蛋白调节CSCs生长和细胞凋亡，已被证实为若干人类癌症的相关治疗靶点。西妥昔单抗和帕尼单抗就是针对EGFR的两种抗癌药物，其与EGFR的细胞外结构域结合，从而阻止受体酪氨酸激酶和与细胞存活、增殖、转移及血管发生相关的多个下游信号转导级联的活化〔42〕。但只有部分患者对此有效，受继发性EGFR突变或其他耐药机制影响，仍有一大部分患者无效，这也就需要新型靶向药物来抑制所有EGFR突变的CRC患者。

miRNA对肿瘤的发生发展具有双重作用，可作为癌基因靶向肿瘤抑制基因，也能够靶向癌基因促进肿瘤细胞凋亡。miR-520家族在肿瘤中异常表达，并且该miRNA家族中的转录物已经被鉴定为致癌基因的关键调节剂〔43〕。Zhang等〔44〕在体外和体内研究中发现，miR-520a-3p通过调节EGFR信号通路抑制细胞迁移，促进细胞凋亡，在G0/G1期导致CRC细胞周期阻滞，并在异种移植小鼠中减慢肿瘤生长。

综上，CRC 干细胞主要包括 Wnt、Notch、TGF-β、Hh、NF-κB、EGFR 等相关信号转导通路，对 CSCs相关通路的调控已经成为预防CRC发生发展及其耐药、转移的重要治疗途径，更进一步地探索CRC CSCs相关信号通路上的分子机制，也会为抗癌药物的发展开拓新思路。而在调控过程中，除了靶向异常信号通路，也会影响正常细胞组织，这就迫切需要将正常组织与肿瘤组织区分开来，更精准地靶向治疗。