大规模平行测序无创基因检测用于胎儿染色体非整倍体异常产前诊断的临床价值

王海 周蕾 王克义 怀磊

出生缺陷不仅严重影响婴幼儿的生命和生活质量，而且会给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。染色体非整倍体异常，是严重的出生缺陷之一，目前尚无有效的治疗方法，其新生儿发病率约1‰～2‰[1]，主要包括21-三体综合征（唐氏综合征）、18-三体综合征（爱德华综合征）、13-三体综合征（帕特综合征）及性染色体非整倍体。早中孕期血清学指标联合胎儿超声指标检测进行产前筛查的灵敏度和特异度欠佳，而传统的产前诊断方法是通过获取胎儿的绒毛、羊水、脐血或者组织来进行诊断，这些侵袭性的方法可能导致宫内感染、流产等不良后果，从而大大降低了产前诊断的依从性。随着孕妇外周血中胎儿游离DNA（cff-DNA）逐渐被学者们证实，利用cff-DNA进行无创产前检测越来越受到关注。研究表明，应用基于大规模平行测序技术的无创产前基因检测（non-invasive prenatal testing，NIPT），通过孕妇外周血cff-DNA对染色体非整倍体如21-三体综合征等检测具有99%以上灵敏度和特异度[2]。笔者选取914例高危孕妇，在早中孕期开展cff-DNA检测，通过与临床金标准技术-羊水细胞染色体核型分析结果进行比较，对大规模平行测序技术在产前诊断中的临床应用价值进行探讨，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 2014年12月至2016年6月在杭州市第一人民医院预约做产前诊断的单胎妊娠高危孕妇共914例，年龄18～48岁，孕周15～22周。排除自身染色体异常、过度肥胖（BMI＞40）、恶性肿瘤、干细胞与移植手术史的单胎妊娠孕妇。根据就诊原因不同，将待检测者分为以下3组：（1）唐氏综合征筛查（唐筛）高危组563例，21-三体综合征的风险切值为1∶270，18-三体综合征的风险切值为 1∶350；（2）高龄组245例，预产期年龄≥35岁；（3）其他原因组共106例，如B超检查发现胎儿颈项透明层（NT）＞3.0mm、室间隔膜部缺损、羊水过多/少、脑室轻度扩张等。本研究经杭州市第一人民医院伦理学委员会批准，所有孕妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 于孕妇进行羊水穿刺前，采集孕妇静脉血7～10ml，使用Cell-Free DNA BCT管（美国Streck公司），采血后颠倒混匀8～10次，24h内进行血浆分离，具体流程如下：（1）采血管以4℃低温下1 600g离心10min，将上清液分装至多个2ml的离心管中；（2）离心管以4℃低温16 000g离心10min，上清液转入新的且已编号的2ml离心管中，置于-80℃低温冰箱保存并做好标记。

1.2.2 血浆游离DNA提取 使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德国Qiagen公司）试剂盒，严格按照说明书操作。提取过程中设置阴性对照和重复对照，采用Qubit Fluorometer核酸定量计检测样品DNA浓度。提取后的DNA用于测序文库制备，在-80℃条件下保存。

1.2.3 文库制备和DNA测序 提取的血浆DNA应用T4 DNA聚合酶（T4 DNA Polymerase）、克列诺片段（Klenow fragment）和T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）对片段末端进行修复。在3′端加碱基“A”使得DNA片段与5′端带有“T”碱基的特殊接头连接。通过PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段并对PCR产物进行纯化，依托美国Life Technologies公司的Ion Proton平台，采用BioelectronSeq4000高通量测序仪器，应用半导体测序法进行高通量基因测序及数据分析，获得不低于500M的有效reads数，平均每个样本不低于5M的reads，测序时优化测序条件以减少GC不均匀分布的影响。

1.2.4 序列的比对和计算 将测序所得序列比对至人类基因组参考序列图谱，使用博奥生物技术有限公司自有软件《无创产前数据分析管理软件》针对比对结果计算每条染色体reads所占比例（%ChrN），sample代表需检测的样品，mean%ChrNreference和SD%ChrNreference分别代表参照样品组平均值和标准差，并利用以下公式计算各个染色体Z值。利用Z值来评估样本染色体的异常情况（cutoff值：｜Z｜=3）。

1.3 诊断方法

1.3.1 评估样本的患病情况 测试样本的ChrN Z-score=（%ChrNsample-mean%ChrNreference）/SD%ChrNreference。例如：测试样本的Chr21的Z值≥3即判定胎儿为唐氏综合征高风险，测试样本的Chr18的Z值≥3即判定胎儿为18-三体综合征高风险。

1.3.2 胎儿染色体核型确诊方法 对NIPT提示染色体非整倍体异常患者，经知情同意后，于孕18～22周经腹羊膜腔穿刺抽取羊水20ml，送遗传实验室常规羊水细胞培养、观察、收获、制片、G显带，根据国际人类细胞遗传学命名体系（ISCN2013）进行核型分析。

1.3.3 阴性结果的随访 检测结果阴性者，胎儿出生半年后电话随访其情况。

1.4 统计学处理 采用Excel 2007统计软件，计算NIPT的假阳性率和阳性预测值。

2 结果

2.1 914例孕妇NIPT检测结果 3组孕妇均完成NIPT，检测结果提示存在染色体异常19例（2.1%），详见表1。

表1 914例孕妇NIPT检测结果（例）

2.2 两种方法检测胎儿染色体非整倍体异常结果的比较 914例孕妇经羊水细胞培养G显带染色体核型分析，发现16例核型结果与NIPT结果一致，包括21-三体 8 例，18-三体 3 例，13-三体 1 例，45，X2 例，47，XXX 1例和47，XXY 1例。3例样本出现假阳性，NIPT提示 45，X 1例，47，XXY 1例和 47，XXX 1 例，而羊水染色体核型分析均为正常核型；详见表2。

表2 两种方法检测胎儿性染色体异常结果的比较

2.3 NIPT临床诊断的准确性 914例标本NIPT阳性19例，阴性895例。19例孕妇的假阳性率、阳性预测值详见表3。

2.4 检测阴性的随访结果 NIPT检测结果阴性者共895例及3例假阳性者，截止至2017年4月，电话随访已出生的新生儿，均未发现有异常患儿。

表3 NIPT临床诊断的准确性[例（%）]

3 讨论

21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、特纳综合征、克氏综合征约占产前遗传疾病的80%～95%[3]，传统产前筛查方法对于这类疾病的产前检测检出率有限，而传统产前诊断技术的创伤性限制了其临床应用。基于大规模平行测序技术的NIPT有效解决了此问题，高通量、大规模且精准的测序已经应用于21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的临床产前检测[4]，并具有高灵敏度和特异度。

2015年Noaon等[5]应用孕妇血浆DNA高通量测序技术进行大规模前瞻性研究，与染色体核型进行比较分析，发现NIPT对21-三体综合征的灵敏度和假阳性率分别为99.9%和0.09%；对18-三体综合征的灵敏度和假阳性率分别为96.3%和0.13%；对13-三体综合征的灵敏度和假阳性率分别为90.3%和0.23%[6]。梅瑾等[7]研究显示应用孕妇血浆DNA高通量测序技术进行胎儿染色体非整倍体检测，该技术对21-三体综合征及18-三体综合征检测的特异度和灵敏度均为100%，阳性预测值100%，而林颖等[8]检测胎儿染色体拷贝数异常的灵敏度和特异度均为100%，邓璐莎等[9]报道为100%和96.7%。本研究对914例孕妇外周血进行大规模平行测序分析，检出21-三体综合征高风险病例8例，18-三体综合征高风险病例3例，13-三体综合征高风险病例1例，与临床金标准方法-染色体核型分析法相比，统计分析显示无创产前基因检测21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的阳性预测值均为100%，而假阳性率均为0，与上述研究报道基本相符，而本研究13-三体综合征的阳性预测值为100%，假阳性率均为0，可能由于样本例数偏少，故不能排除小概率事件的发生。对于性染色体非整倍体产前检测，NIPT技术的准确性在国内外研究报道则差别较大，国内研究中，段红蕾等[10]对13 041例进行NIPT检测的病例进行回顾性分析，发现NIPT技术对性染色体数目异常的阳性预测值仅为40.9%；而 Mazloom 等[11]研究中 NIPT 对 45，X、47，XXX和47，XXY的检出率分别为83%、85%及83%。本研究中出现3例假阳性，NIPT提示45，X1例，47，XXY1例和47，XXX1例，而羊水染色体核型分析均为正常核型，结果显示45，X的假阳性率为0.11%，阳性预测值为66.7%，47，XXY 和 47，XXX 的假阳性率均为 0.22%，阳性预测值均为50%，这可能与纳入人群和标本量有关。造成胎儿性染色体非整倍体异常NIPT与羊水核型分析结果不一致的原因众多,孕龄、体重指数,X染色体GC含量偏移，X和Y染色体高度同源[12]，胎儿分数、胎盘嵌合、母体嵌合以及母体X染色体拷贝数变异等[13]，都影响NIPT结果的准确性，导致假阳性率过高[14]。

综上所述，NIPT对胎儿常染色体非整倍体异常（21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征），具有极高的阳性预测值和极低的假阳性率，是一种“近似于产前诊断水平的”产前筛查技术；但对胎儿性染色体非整倍体异常检出的阳性预测值较低，因此NIPT只能作为一种高级筛查性检测而不是确诊方法，筛查阳性病例需要通过进一步用传统的侵入性产前诊断确诊。因此在现有产前筛查、产前诊断模式中，对于NIPT的定位应作为现有产前筛查体系的后续补充，也就是作为高级别的筛查技术存在，作为高风险或临界风险病例的二次筛查模式，后续与当前的侵入性产前诊断技术体系相结合[15]。

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