睾酮对动物生殖和生长发育影响的研究进展*

张阳海，李 永，曹 迪，鱼 婷，高佳阳，潘传英

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

睾酮(testosterone, T)主要由雄性的睾丸间质细胞(Leydig cells, LCs)产生，由雌性的卵泡膜细胞产生，受下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)和许多细胞因子的调控。T对促进性器官发育、精子发生和早期卵泡发育，以及维持第二性征等具有重要意义。T也参与其他组织器官的生理活动，如维持骨量、保护神经和心血管系统、调节皮脂分泌等[1]。T水平异常可导致精子发生受阻、排卵障碍和体内激素水平失衡，进而诱发中老年男性迟发型性腺功能减退症、雌性多囊卵巢综合症、骨质疏松和痤疮等疾病[2-5]。目前，针对这些疾病主要采用T补充疗法和药物抑制疗法。虽然可以缓解症状，但也存在许多副作用[2,6]。因此，阐明T的来源途径和作用机制，以找寻一种长期有效又无毒副作用的治疗方式，是当前研究中亟待解决的问题。目前，关于T的研究多在大鼠和小鼠等模式动物上开展，而哺乳动物LCs分化发育的作用机理，以及T作用于生殖、骨骼、皮肤、心脑血管等系统的信号通路不甚清楚。为此，本文从LCs的分化和成熟、T的合成和合成调控以及T对动物生殖与生长发育的影响等方面进行综述，以期为T的进一步研究提供参考。

1 睾丸间质细胞的分化和成熟

在雄性睾丸中，合成和分泌睾酮的细胞称为LCs，由德国解剖学家Franz Leydig最早在大鼠睾丸间质中发现并命名[7]。哺乳动物LCs分为两种类型，即胚胎期的胎儿型睾丸间质细胞(fetal Leydig cells, FLCs)和出生后生成的成熟睾丸间质细胞(adult Leydig cells, ALCs)[7]。在啮齿类动物中，FLCs的数量在出生后一周内逐渐减少，仅一小部分存留于成年体内；与此同时，ALCs代替FLCs成为最主要的睾酮合成细胞[7-8]。众多研究表明，ALCs不是由FLCs直接分化形成。存在于睾丸间质腔隙的睾丸间质干细胞(stem Leydig cells, SLCs)才是ALCs真正的细胞来源[8-10]。迄今为止，科学家们对于FLCs和SLCs的细胞来源做了大量研究，提出了多种可能：前者包括神经嵴细胞、体腔上皮细胞和血管周细胞，后者包括血管平滑肌细胞和管周间质细胞，但目前尚无确凿证据表明其细胞来源[7,11]。

SLCs作为LCs的干细胞，主要起维持LCs数量的作用。因此，通过移植SLCs来治疗T缺乏及其并发症是目前最具前景的治疗方法。2006年，Ge等[12]从7 d的大鼠睾丸中分离出了一类具有自我更新和分化为LCs能力的细胞，并成功建立其培养体系，首次在大鼠上证实了SLCs的存在。Landreh等[13]从人睾丸中成功分离出睾丸管周细胞，并发现其具有SLCs的细胞特性。2011年，本课题组Yu等[14]成功从仔猪睾丸中分离得到猪SLCs，并建立其短期培养体系。迄今为止，相比于大鼠SLCs，其他哺乳动物SLCs长期培养体系还未完全建立[15]，SLCs的研究仍有很大的发展空间。

SLCs分化为ALCs需经历睾丸间质祖细胞(progenitor Leydig cells, PLCs)和未成熟的睾丸间质细胞(immature Leydig cells, ILCs)两个过渡阶段[11]。在该过程中，HPG轴协同IGF-1、PDGFa、TGFα等细胞因子共同调控LCs的增殖、分化和成熟，其中以垂体分泌的LH起主导作用[7，11]。在LCs成熟过程中，细胞体积逐渐增大，形态由梭形逐渐变为圆形；细胞质内脂滴含量减少，光面内质网数量增多；细胞分化程度越来越高，类固醇激素合成酶和相关转运蛋白的表达增强。最终，在ALCs阶段，促黄体素受体(luteinizing hormone recepter, LHR)和类固醇激素合成酶的表达量达到顶峰[16]。

2 睾酮的合成与合成调控

T是雄性体内最主要的性激素，以胆固醇为原料在LCs中合成。LH是T合成过程中主要的调节激素，通过激活cAMP和Ca2+这两个信号分子，促进T产生。T的合成同时受到FGFs、IGF-1、EFGα、TGFα和TGFβ等细胞因子的旁分泌作用。

2.1 睾酮的合成

ALCs是合成T最主要的细胞类型，而PLCs和ILCs由于分化程度不高，类固醇激素合成酶不能完全表达，故该阶段主要生成其他雄激素代谢产物[11]。ALCs合成T主要包括三个步骤(图1)[11,17-19]。

2.1.1 胆固醇从线粒体膜外转运到膜内 细胞内的胆固醇来源广泛，可由内质网合成，也能由细胞内的脂滴转化得来；细胞外的低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)都可作为胆固醇的前体物质，在人LCs中，细胞外的LDL通过受体介导的内吞作用进入细胞，而啮齿类动物主要通过B类Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor B1, SRB1)将HDL转移至胞内[18-19]。随后，TSPO(translocator proteins)将胆固醇从线粒体膜外转运到膜内；在此过程中，垂体释放LH，促使类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达，进一步促进胆固醇转运[17]。

2.1.2 胆固醇转化为孕烯醇酮 胆固醇在线粒体内膜的胆固醇侧链裂解酶细胞色素P450(cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc)的催化下生成孕烯醇酮(pregnenolone，PREG)[11]。

2.1.3 PREG转化为T PREG转运至光面内质网后，被3β-HSD酶解为孕酮(progesterone)，随后在17-20裂解酶细胞色素P450(17a-hydroxylase/17,20-lyase, P450c17)的作用下先后生成17-羟孕酮(17-OH-progesterone)和雄烯二酮(androstenedione)，后者经17β-HSD的作用生成T[11]。

在该合成过程中还生成17-羟孕烯醇酮、脱氢表雄酮和雄烯二醇等中间产物，此处并未列出。

2.2 睾酮的合成调控

T的合成和分泌主要受HPG轴调节。垂体分泌LH，激活第二信使，动员胆固醇生成T。除此之外，FGFs、IGF-1、TGFα、25-羟基胆固醇和TGFβ等细胞因子也能影响T合成。

图1 ALCs中睾酮合成途径[11,17-19]Fig.1 Biosynthesis pathway of testosterone in ALCs

下丘脑分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)促使垂体释放LH，LH与LCs细胞膜上的受体特异性结合，激活腺苷酸环化酶，促使胞内cAMP水平升高，激活PKA。随后PKA通过基因作用促进StAR表达，加速胆固醇转运[17]。Costa等[20]在小鼠中发现，LH可通过激活PKA和PKC，促使T型钙离子通道开放，使Ca2+大量涌入LCs细胞内，影响T的合成。推测除cAMP以外，Ca2+也可能作为LH调节T合成的第二信使。

T合成和分泌过程除了受经典的LH调控以外，某些睾丸内旁分泌因子和体内其他激素也能影响T合成和分泌[8]，例如支持细胞(sertoli cells,SCs)能分泌FGFs、IGF-1、TGFα和EFGα等多种细胞因子参与T合成过程，其中IL-1α、生长激素和胰岛素可以通过调节IGF-1的表达，间接影响T合成；巨噬细胞与LCs直接接触或通过分泌25-羟基胆固醇和其他细胞因子，影响LCs正常发育和功能发挥。此外，TGFβ、IL-1、TNF-α、干扰素-γ等因子能抑制类固醇激素合成酶的活性，从而减少T的生成[21]。而GnRH和内皮素-1可与LCs细胞膜上的特异性受体结合，刺激Ca2+浓度升高，增强T生成能力[22]。除上述因子的调节作用以外，降钙素、促肾上腺释放激素等物质也影响T合成，但其具体机制尚不清楚。

3 睾酮对生殖与生长发育的影响

3.1 睾酮对生殖的影响

T作为哺乳动物体内重要的性激素之一，对维持雄性和雌性正常生殖功能具有重要意义。对雄性来说，T在胚胎期影响胎儿性别分化，而在初情期后主要调控精子发生并维持雄性第二性征；对雌性来说，T主要具有促进卵泡发育成熟和排卵的作用。

3.1.1 T对雄性生殖的作用 雄激素受体(androgen receptor, AR)属于类固醇激素核受体家族的一员，是T和双氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT)发挥作用的中介物质[1]。通过构建敲除AR基因(AR knockout, ARKO)的小鼠模型，发现小鼠睾丸内与精子发生相关的蛋白质表达量改变，表现为生精障碍[23]，提示AR作为T功能发挥的中介物质，对精子发生有着重要意义。目前生殖细胞(germ cells, GCs)上是否存在AR仍有争议，但可以确定其对精子发生无影响[23]。而SCs、管周肌样细胞(peritubular myoid cells, PMCs)和LCs中均证实存在AR表达，针对这些细胞类型构建的ARKO小鼠表现为精子发生受阻[24]，证实了T可通过AR作用于这些细胞，调控精子发生。

SCs的AR表达呈生精细胞发育阶段依赖性调控[24-25]。SCs受T调节作用，分泌多种信号因子，为GCs的增殖分化提供支持和营养作用。SC-ARKO小鼠表现为生精过程阻滞，精子缺失甚至不育[24]。SCs还可形成血睾屏障(blood-testis barrier, BTB)，使GCs免受外界不良环境的影响，为精子发生创造独特环境[26]。而T可以调节BTB相关蛋白质的表达，维持BTB的完整性，保障精子正常发生[27]。

PMCs具有丰富的AR且持续稳定表达[24]。Chen等[28]发现，PMC-ARKO小鼠精原细胞大量缺失，表明T可能作用于PMCs，间接维持精原干细胞数量。Norton等[29]研究表明，PMCs受T刺激，合成并分泌旁分泌因子(P-Mod-S)，以维持SCs正常功能，调控精子发生。Welsh等[30]还发现，PMC-ARKO小鼠LCs发育异常，提示PMCs也可能通过旁分泌作用影响LCs发育。

LCs不仅是合成和分泌T的细胞，也是T作用的靶细胞。O'Hara等[31]在LC-ARKO小鼠模型上发现LCs无法分化为ALCs，猜测T可能通过自分泌作用影响LCs发育。而在同样的研究模型上还发现LCs合成的类固醇合成酶类减少[23]，表明缺乏T会影响自身的合成量。目前所知有两条通过负反馈作用于HPG轴从而抑制T自身生成水平的途径[7]：当睾丸内睾酮水平过高时，T反作用于下丘脑，促使GnRH释放，影响LH和促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)，一方面，LH直接作用于LCs，减少睾酮的生成；另一方面，FSH促使SCs释放雄激素结合蛋白(androgen binding protein, ABP)，ABP可与T结合，减弱T活性，从而达到控制局部T水平的作用。

因此，睾酮能调控SCs、PMCs、LCs等细胞，发挥正常功能，促进精子发生相关蛋白质和细胞因子的表达，维持雄性正常生殖活动。目前，除T与AR结合发挥生物学效应的基因作用研究较为透彻外，其余两条非基因组作用仍存在疑点。例如，除SCs细胞，该途径是否在其他细胞中也同样适用；被T激活的Erk是否能直接调控ARE影响基因转录；以及在Ca2+通路中是否与T结合的膜受体为G蛋白偶联受体等，这些问题仍有待进一步研究。

3.1.2 睾酮对雌性生殖的作用 在雌性卵巢中，T受LH调控生成于卵泡膜细胞，随后进入颗粒细胞转化为E[32]。Sen等[33]通过基因敲除手段，去除雌性小鼠卵巢AR，结果显示卵泡发育受损，提示T能结合AR调控卵泡细胞发育。AR在卵泡发育早期表达量较高，之后随着卵泡发育逐渐减少，表明T可能只参与早期卵泡发育阶段[32]。T主要通过增加卵巢内促卵泡素受体(follicle- stimulating hormone recepter, FSHR)、IGF-1及其受体的表达，提高FSH和IGF-1活性，从而促进卵泡发育[34-35]。此外，T对维持子宫内膜组织内环境稳定和乳腺发育也起着重要作用[36-37]。

适量的T能促进卵泡发育和排卵，但水平过高可能会引发雌性生殖疾病[3]。多囊卵巢综合症(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一种常见的排卵障碍疾病，临床表现为卵泡发育障碍、高雄激素血症和胰岛素抵抗[38]。近年来，针对PCOS提出的“胎儿期编程学说”可作为T水平过高引发PCOS的证据之一，即胎儿在母体T高水平环境的刺激下，改变T合成相关物质的表达，最终引起一系列PCOS临床表现[39]。高水平T导致PCOS的作用机制可能为：①调节卵巢内某些细胞因子的表达，影响卵巢正常生理功能[38]；②刺激FSHR大量表达，导致颗粒细胞过早增殖、卵泡提前发育，使卵泡未完全发育成熟就已发生闭锁[38]；③早期卵泡发育过快，可供选择的优势卵泡太多而发生紊乱，导致大量卵泡处于生长停滞期[40]。

3.2 睾酮对生长发育的影响

T作为哺乳动物体内一种重要的激素，除了发挥与生殖相关作用以外，还广泛参与机体各项生命活动，对蛋白质合成、骨量维持、皮脂分泌、神经系统和心血管系统的保护等方面有重要意义[1]。

T对骨量维持十分重要，一方面能通过促进成骨细胞的分化发育来维持骨骼生长，另一方面能抑制骨吸收，改善骨质疏松[4]。中老年男性由于T水平低下，容易引起骨质疏松，使骨折发生率升高[4]。Gill等[41]研究发现，T能提高大鼠骨细胞中TGFβ的水平，从而维持骨量平衡。Huang等[42]研究表明，ARKO小鼠抑制了骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的能力，但促进了BMSCs脂肪形成，这可能是由于T结合AR后调节IGF导致的。Steffens等[43]通过抑制大鼠T生成，发现其体内破骨细胞数目增多；而对照组补充T后，破骨细胞数目呈T剂量依赖性减少，证实了T能维持骨量平衡。Finkelstein等[44]对抑制E水平的男性采用T补充治疗后，仍无法改善其骨质疏松症状，表明在性激素T和E中，后者可能在成年男性骨代谢中占主导地位。此外，TNF、IL等细胞因子也参与T调节骨细胞生长过程，但具体作用机制仍存在争议[43]。

T能调节多种细胞因子，发挥神经保护作用。对患有神经性退行疾病的老年人进行T补充治疗，患者的记忆力和认知水平明显得到提高[45]。Li等[46]在雄性SAMP8小鼠上发现，T可以上调海马神经元细胞SYN的表达，猜测可能对改善认知能力有帮助；洪雷等[47]研究发现，生理水平的T能提高亚急性衰老小鼠的学习记忆能力，这可能是通过改善海马CA1区形态和神经元数量实现的；而Qiu等[48]研究表明，T能调控成年雄性小鼠海马区SRC-1的表达，猜测可能也与学习记忆能力的改善有关。2015年，Bing等[49]研究报道，DHT可以通过PI3K/Akt途径上调seladin-1、bcl-xl等表达，减少bax表达量，从而显著降低了大鼠c6神经胶质细胞的凋亡率，最终发挥神经保护作用。此外，T的脑保护作用还涉及抗自由基、抗神经细胞凋亡、调节神经元毒性易感性等多种机制，调控网络十分复杂，还需进行长期深入的研究。

T能通过基因作用和非基因作用介导心肌细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞等心血管系统主要功能细胞，参与心血管疾病的调节[50]。Nheu等[51]发现，T能激活内皮细胞PI3K/Akt、ERK1/2等信号途径，磷酸化eNOS，促进NO合成。Deenadayalu等[52]以猪冠状动脉为试验材料，发现T可以刺激冠脉平滑肌合成NO，促进cGMP生成并激活PKG，从而舒张血管。此外，T还可以抑制血压、血脂和血糖的升高，改善内皮损伤、细胞增殖迁移能力减弱、血管衰老等心血管疾病，对心血管系统起到一定的保护作用。但T在心血管疾病中的作用是复杂且有争议的，许多病理机制尚未完全阐明，仍需深入研究。

皮肤可表达AR和多种类固醇激素合成酶。相对于其他皮肤结构来说，皮脂腺和毛囊对雄激素敏感度更高，更易引起皮肤病的发生。在痤疮患者中测得AR和5α-还原酶表达量最高，使得T更多的向活性更强的DHT转化，刺激皮脂过度分泌，更易引发痤疮。痤疮发病的作用机制尚不明确，猜测可能是T通过影响FGFR2[5]、IGF-1[53-54]和TNFα等[55]细胞因子，增强皮脂分泌水平。而在皮肤的毛囊细胞中，T和DHT会导致毛囊缩小，毛发周期缩短，最终形成雄激素源性脱发(AGA)。毛发生长周期复杂，受TGFβ-1、TGFβ-2、DKK-1和IGF-1等细胞因子调控，T和DHT可以诱导上述因子表达，影响毛发生长[56]。此外，Kretzchumar等[57]发现，AR可能通过β-连环蛋白/Wnt信号通路，参与毛囊发育和皮脂腺分化。

T能广泛参与机体生命代谢活动，除了对骨骼、脑组织、心血管系统和皮肤等有影响以外，还能促进蛋白质合成、影响糖脂代谢和维生素表达，并产生免疫抑制作用。T可以改变某些因子分泌，影响细胞生长发育和凋亡。但在不同组织器官参与调节的因子不同，导致T对机体的作用机制可能有着多种实验结论；即使是同种因子，其发挥的作用可能也不同。目前的研究不能完全解释T的作用机制，仍有待进一步研究。

4 问题与展望

雄性LCs受HPG轴调控，合成并分泌T；T通过与AR结合的基因调控或其他非基因调控，影响动物生殖和生长发育过程中P-Mod-S、IGF、NO等物质的表达。因此，LCs和T的正常功能发挥，对保障动物健康有重要意义。但迄今为止，LCs分化发育的调控，以及T影响动物体内各组织器官的作用机制还未研究清楚。例如：①SLCs作为LCs的前体细胞，其起源和长期培养体系尚未完全建立；②LCs的分化发育及合成T的过程，受多种激素和因子的影响，是十分复杂的调控系统。但先前的研究并未完全阐明该调控系统，且某些尚未研究的物质可能也参与其中；③T调控生殖细胞和其他体细胞的信号通路众多，包括T的基因作用和非基因作用，涉及AR、Erk、CREB、Ca2+等多种物质参与。目前，对该方面研究还不够清楚，T在其中所扮演的角色还有待查明。因此，关于T的作用机制还需科学家们继续补充完善，以期为研究T和相关生理过程提供参考资料。

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