氧化应激、线粒体功能障碍与帕金森病

梁志刚 罗鼎真 王晓民

(青岛大学附属烟台毓璜顶医院神经内科，山东 烟台 264000)

抗氧化、保护线粒体功能可能是帕金森病(PD)治疗和神经保护的重点。本文对近几年氧化应激、线粒体功能障碍与PD研究进展做一综述。

PD于1817年由英国医生James Parkinson首次报道，是一种以黑质纹状体系统选择性、进行性变性为主要特征的中老年期运动障碍性疾病。其主要病理改变是黑质致密区(SN)多巴胺(DA)能神经元变性、死亡，残存神经元胞质内嗜酸性包涵体即Lewy 小体(LB)形成，导致纹状体中DA含量减少，该病典型临床症状为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍。这些运动障碍从发病伊始就呈渐进性加重过程，患者生活无法自理，最终死于肺部感染等并发症。由于DA能神经元退行性病变发生的真正原因和机制尚不明确，PD的预防及治疗都非常困难，目前临床上主要治疗手段是左旋多巴(L-DOPA)药物替代疗法和手术治疗，这些措施虽能够在短期内改善PD患者的症状，但不能阻止或延缓DA能神经元的进行性变性过程，所以远期疗效无法令人满意。因此以延缓或阻止黑质DA能神经元进行性变性过程为靶点的神经保护性策略是PD治疗学的发展方向。针对PD发病机制的研究热点，多种抗氧化应激、改善线粒体功能及持续性DA受体刺激的药物逐渐被应用于PD的治疗，这些药物有望延缓疾病进程，更好地改善临床症状。

1 氧化应激与PD

1.1自由基和氧化应激的概念 氧化应激是指机体内氧自由基的产生与清除失去平衡，外源性氧化剂的过量摄入导致活性氧在体内堆积引起细胞毒性。过量的自由基以进攻多不饱和脂肪酸可引起脂质过氧化，导致生物膜结构和功能的改变; 损伤蛋白质的巯基和氨基使蛋白质变性、交联，使酶的活性丧失; 损伤DNA 可导致细胞突变。种种有害后果与许多疾病如肿瘤、炎症、衰老、神经退行性疾病的发生有密切关系〔1〕。

近几年研究证明氧化应激产生的过量自由基不但直接攻击生物大分子发挥损伤作用，而且自由基可以作为信号分子启动一系列病理生理过程。外界刺激在信号传递过程中产生活性氧(ROS)，而ROS 又可以刺激信号通路，参与细胞信号转导过程。在细胞凋亡信号转导的过程中，ROS 既可以作为外界诱因，又是其他诱因在体内激发凋亡的一种中间产物，其机制可发生在凋亡过程的各环节，包括直接诱导凋亡或影响与凋亡有关的细胞内信号转导和基因表达。氧化还原调节可以发生于从受体到细胞信号通路的多水平环节，ROS 可通过细胞膜靶标将刺激信号由细胞膜传至细胞内，作用于细胞内靶标激发信号级联反应，诱导细胞凋亡。氧化应激是神经元变性-死亡这一进程中的早期事件。

1.2中脑黑质对自由基损伤的易感性 由于解剖和生理等因素，正常大脑组织富含不饱和脂肪酸，因为代谢需要又必须承受与自身重量不相称的高比例氧耗，所以大脑是对自由基损伤的易感器官。中脑黑质因为以下原因对自由基损害更敏感：(1)自身保护机制相对薄弱，黑质致密部谷胱甘肽(GSH)和抗氧化酶的含量较其他脑区少；(2)DA能神经元中的神经黑色素对Fe3+的高亲和力使黑质中聚集了高浓度的Fe3+，并可随时转为活化的Fe2+，Fe2+可与H2O2发生Fenton反应生成攻击性更强的·OH〔2〕。(3)黑质致密部小胶质细胞的比例较其他脑区高，异常激活的小胶质细胞是活性氧自由基和毒性细胞因子的重要来源；(4)DA氧化代谢的过程中即可产生一定量的自由基，外界毒素也可通过阻断线粒体呼吸链的电子传递而产生大量自由基；而且DA 能神经元的数量减少可导致残余DA能神经元的代谢活动代偿性增强，H2O2生成增多，进而导致毒性·OH的聚积，细胞处于严重的氧化应激状态〔3，4〕。因此推测PD的发生正是由于自由基的产生与清除之间正常的平衡受到了严重破坏，最终导致DA能神经元的死亡。

1.3PD的氧化损伤标记 有大量研究在关于PD患者尸体解剖组织中的研究寻找到氧化应激的指标。脑组织富含磷脂和不饱和脂肪酸，二者均易于受到氧化应激的损伤，PD患者黑质多不饱和脂肪酸的浓度降低，而丙二醛(脂质过氧化指标)增高〔5〕。氧化应激对蛋白损伤的指标水平，如可溶性蛋白的羰基化修饰在PD患者的尸体标本中亦明显增高〔6，7〕。活性氮的重要指标自由与结合的硝基酪氨酸，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)小鼠模型脑内损伤区增高，PD患者脑内触核蛋白于Parkin蛋白硝基化与亚硝基化亦有报道〔8〕。PD的动物模型及病人脑组织中存在氧化损伤，表明氧化应激参与了PD的发病。

1.4氧化应激在PD发病机制的重要作用 氧化应激是受到关注最多的一种PD发病机制。尸检结果表明PD病人黑质部位存在严重的氧化应激，如游离铁离子增多〔9〕、GSH含量下降〔10〕、线粒体复合体Ⅰ功能受损〔11〕及大量被氧化损伤的脂质、蛋白质和DNA等等；MPTP 或6-羟基多巴(OHDA)等神经毒素也可在体内产生自由基，破坏纹状体DA 能神经元，使人类及实验动物出现帕金森综合征表现，这些都提示氧化应激可能与PD的发生和进展密切相关。自由基是引起氧化应激的基础，目前认为PD脑内神经黑色素、铁、DA代谢和线粒体功能异常及代谢酶的缺乏是产生自由基的主要来源。PD 患者黑质DA神经元的变性是一个持续渐进且主动的自我延续过程，而持续的炎性反应促进了这一过程。炎性细胞因子可能主要通过氧化应激损害促进了DA能神经元的变性和死亡。从一些早期发病的家族性PD患者第4 号染色体中发现两个单独的α-synuclein 基因错义突变后，α-synuclein蛋白在PD 发病机制中的作用受到广泛关注。有实验表明，过度表达的野生型或突变的α-synuclein 本身对细胞并没有任何毒性作用，但是突变的α-synuclein过度表达增加了神经细胞对氧化应激的易感性〔12〕。更重要的是，至今在PD病人的黑质部位仍未发现存在突变的基因或者外源性毒物可以抑制线粒体功能，因此还不能肯定氧化应激的起因及其和线粒功能障碍之间的时程关系。另外，现在仍未确定PD病人黑质部位起关键作用的自由基类别，早期人们认为ROS，因为DA代谢产生H2O2和·OH，而且1-甲基-4苯基吡啶(MPP)+也通过抑制线粒体功能和干扰DA在胞内的贮存而产生大量O2-。不过这一设想还没有得到直接证据的支持，而且MPP+的神经毒性作用与O2-之间也没有很好的相关性〔13〕。大量的实验都支持活性氮(RNS)在DA能神经元退变机制中扮演了重要角色。PD病人黑质LB中含有3-硝基酪氨酸和硝基化的α-synuclein，表明过亚硝酸盐可能参与对DA能神经元的损伤过程〔14，15〕。PD病人黑质内可诱导型的一氧化氮合酶(iNOS)免疫活性增强，这可能是小胶质细胞中iNOS表达上调的结果〔16〕，过多的一氧化氮(NO)扩散到DA能神经元，可以与酶的巯基部位发生亚硝化反应，抑制线粒体复合体Ⅰ和Ⅳ〔17〕。

NO还可能通过结合铁蛋白而增加游离铁离子的浓度；NO还能选择性地抑制GSH还原酶，引起GSH含量下降。MPTP的损伤机制中也有NO参与，使用NO合酶(NOS)抑制剂可以保护小鼠和猴免受MPTP的损伤。目前还不能确定哪一类自由基的作用更重要，ROS和RNS更可能是同时发挥作用的，NO和O2-反应形成过亚硝酸盐，继而又分解生成-OH，这些都是氧化应激过程中发挥损伤作用的重要因素。

过量的自由基如果超出DA能神经元的清除能力，就会导致细胞结构的严重破坏。受氧化损伤的细胞成分不仅丧失了生理功能，还可能继续发挥毒性作用：羰基化的蛋白质不易被泛素蛋白酶体系(UPS)识别和降解而积聚，破坏细胞内环境；DNA损伤可能会造成重要分子的错误编码。可见氧化应激是造成DA能神经元退变的一个重要机制。氧化应激被认为是PD患者黑质神经元死亡的主要因素。DA在氧和水的存在下，受单胺氧化酶作用生成过氧化氢、醛和氨。H2O2可导致毒性自由基增加，于是诱发氧化应激反应。自由基对神经元的损害主要表现在如下几方面：细胞膜发生脂质过氧化反应，膜磷脂被破坏降解；细胞膜对钠，钙及大分子物质通透性增加，神经元发生细胞毒性水肿；线粒体破坏，功能丧失。尽管多项研究支持氧化应激参与了DA能神经元变性和死亡过程的启动、发生及发展，因为在尸检中所见的多是疾病末期的状态，所以，PD病人黑质DA能神经元进行性死亡的机制非常复杂，氧化应激、线粒体功能障碍、异常免疫炎症反应、蛋白质水解应激和兴奋性毒性等机制相互关联，组成复杂的有害网络，在多因素的触发下启动，可能不依赖于病因而导致DA能神经元的进行性退变。

2 线粒体功能障碍与PD

线粒体是细胞能量产生的初级场所。毒性物质可以通过抑制线粒体复合物Ⅰ来影响线粒体呼吸链导致ATP产生减少，最终导致细胞因能量耗竭而死亡〔18〕。对于线粒体代谢异常的直接证据来源于病人的尸检组织于离体的细胞培养。其中尸检的一个重要发现表明在PD病人的黑质和前脑皮质中线粒体氧化呼吸链复合物Ⅰ(电子传递链的重要组成部分)功能下降，应用先进的免疫捕获技术能证明氧化应激的增加和呼吸链复合物Ⅰ电子转移率的下降〔19〕。此外在体研究发现，MRS研究检测到PD病人颞顶叶区及枕叶高能磷酸水平下降，并导致线粒体相关的代谢异常引起无氧代谢。线粒体功能障碍导致氧化应激加重，氧化损伤脂质、蛋白、DNA，同时降低了重要的抗氧化物质，在PD患者尸解脑组织内可以发现谷胱苷肽下降〔20～22〕。环境和遗传因素导致的线粒体功能障碍，能引起ROS的过度生产并启动了PD DA神经元细胞的凋亡。过氧化物产生并导致损伤部位远端的任何电子传递链抑制而促进了线粒体自由基的产生。能够诱导PD神经病理的神经毒素，如MPP+，鱼藤茼刺激了电子传递链复合物Ⅰ的过氧化物的生成并刺激邻近线粒体基质氧化还原部位自由基产生。

3 抗氧化药物治疗PD的研究进展

基于氧化应激反应增强和氧自由基清除系统的缺陷在PD 发病机制中的重要作用，为了确定自由基是否为有价值的神经保护治疗靶点，国内外学者在多种PD模型中对各种抗氧化策略进行了探讨，这些策略包括抑制自由基生成、清除自由基或增强内源性抗氧化系统的功能等。儿茶酚-氧-甲基转移酶(COMT)抑制剂、单胺氧化酶(MAO)-B抑制剂和DA受体激动剂，通过降低DA更新率，阻断或减少DA的合成、释放或氧化代谢来减少自由基生成，从而抑制氧化应激反应，减轻自由基对黑质DA能神经元的损害。其中MAO-B抑制剂(司雷吉兰、雷沙吉兰)近年来临床基础研究都表明其可能具有抗氧化的神经保护作用，是目前临床上对PD患者修饰治疗的首选。自由基清除剂通过清除活性氧，阻断呼吸链反应来减轻自由基的损伤。维生素E(VitE)是血浆中最强的脂溶性抗氧化剂，但临床研究结果并不支持PD患者使用VitE，究其原因可能有：PD患者脑中VitE水平本来正常，无须给予；所使用的VitE剂量太小，脑内VitE的浓度不足以产生抗氧化效应；VitE选择性作用于H2O2而不是·OH，而·OH引起脂质过氧化，而H2O2是在脂质过氧化连锁反应中形成，或许研制渗透性更好的VitE新制剂会对PD的治疗有效。维生素C(VitC)是血浆中最强的水溶性抗氧化剂，可以消除过氧自由基和防止脂质过氧化的启动，保护血浆脂质免遭氧化损害。但VitC也能提供电子，促进三价铁转换成反应形式的二价铁，起着前氧化剂的作用。因为PD患者脑结合铁的能力相对缺乏，脑内铁的水平又有增高，在使用VitC治疗PD时应谨慎。

美国PD神经保护治疗药物开发委员会(CINAPS)对目前可能有效的PD神经保护药物进行了系统性的评估，其中60%的神经保护剂研究集中在抗氧化及线粒体保护方面。美国有研究表明口服辅酶Q10(1 200 mg/d)加用维生素E可以阻止PD进展。而PD神经保护探索试验(NET-PD)2 400 mg/d的辅酶Q10未能证实能上述作用，新辅酶Q10的Ⅲ期临床试验也即进行过程中，以进一步确定辅酶Q10临床治疗作用〔23～25〕。线粒体保护治疗是PD的新的治疗途径，但需要进一步的研究。辅酶Q10是一种天然的保护线粒体复合物Ⅰ电子传递而影响线粒体去极化的抗氧化剂。PD患者分离出来的线粒体中辅酶Q10的含量较少，辅酶Q10减少的比率在PD患者中明显高于对照组，说明氧化应激在PD患者中的增加。在小鼠和灵长类动物，辅酶Q10保护DA神经元免受百草枯诱导的氧化应激、鱼藤茼暴露及急慢性MPTP诱导的DA能细胞的死亡〔26～28〕。肌酸，磷酸肌酸，一种高能磷酸键，提高细胞活力并能保护线粒体膜通透孔开放。能减少MPP+介导的对胚胎中脑腹侧神经元细胞毒性作用〔29〕。我国学者研究发现丁苯酞对PD患者的治疗保护作用，中药单体及一些有效成分如黄酮类及多糖类、皂苷类对PD细胞及动物模型具有抗氧化及线粒体保护作用。尿酸作为水溶性外源性抗氧化剂，研究认为可能对PD患者具有神经保护及疾病修饰作用〔30〕。近年来对于保护线粒体结构和功能复合细胞通路的研究进展，出现了更多的治疗靶点〔31〕。过氧化物体增殖体激活受体Y共激活物过氧化物酶体增殖物活体受体协同刺激因子(PGC)-1α是一种能调节线粒体发生起源和能量代谢的转录子激活物，能保持能量代谢的稳定。白藜芦醇，3′，4′，5-三羟(基)芪，一种葡萄皮提取的多聚苯提取物能过激活PGC-1α与沉默信息调节因子2相关酶(SIRT)1而保护线粒体能量代谢〔32〕，并能保护MPTP对小鼠的DA能神经元损伤〔33，34〕。

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