猪的基因编辑技术现状与展望

张文举，杨 智，王晓圆

（1.吉林省梨树县孤家子镇畜牧站动物检疫监督所，吉林 梨树 136506；2. 安徽省太和县动物卫生监督所，安徽 太和 236600；3.吉林省吉林市船营区动物卫生监督所，吉林 吉林132000）

1 介绍

基因编辑是指通过基因工程技术对生物体的特定基因进行精确改造，包括删除，替换或插入单个核苷酸或某段DNA序列，以达到预期的基因型或表型。目前，应用较广泛的基因编辑技术主要有三类，包括锌指核酸酶（Zincfingernucleases,ZFNs）、类转录激活因子核酸酶（Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs）和规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR/Cas）。现如今应用最广泛的基因编辑技术为CRISPR/Cas9系统，被广泛地应用到生物学、农业、医学和临床等多个领域，用该技术制备基因编辑动植物等已有数十种，且效率高，速度快。在动物育种、医学模型、器官移植和临床治疗等领域都表现出巨大的应用价值。在CRISPR/Cas系统尚未问世以前，制备基因编辑动物是非常困难的，因为成本高、周期长、操作繁琐，尤其是制备大动物猪、牛、羊等。在科研人员的不断努力下，使得CRISPR/Cas系统面向世人，才把制备基因编辑动物变得简单容易，尤其是基因编辑猪。随着人们生活水平提高，逐渐对猪肉的品质有更高的需求，如瘦肉率、肌内脂肪、酸碱度和肉色等性状。需求的增加导致越来越多的猪育种人员及大型养殖企业采用基因编辑猪育种，以满足市场和人们的需求。猪与人的亲缘关系近，体型大小和生理病理等特征与人相似，是比较合适的医疗模型和器官移植供体。因此，世界各地的科研工作者不断地利用基因编辑技术制备基因编辑猪。而我国是制备基因编辑猪最多的国家，已经在猪育种，医疗模型上取得了突破的进展。文章将结合基因编辑猪在各领域的应用状况，存在的问题及潜在的应用前景进行阐述。

2 新型基因编辑技术

在科研人员的不断努力下，基因编辑技术迅速发展，从传统基因编辑技术发展到新型基因编辑技术，技术体系被不断地完善。从传统的效率低、成本高、周期长和操作繁琐到新型的效率高、成本低、周期短和操作简单，使得基因编辑技术趋于简单化，规模化，在制备基因编辑动物方面也变得轻而易举。如今，全球多家大型育种公司和企业均已利用新型基因编辑技术制备规模化的基因编辑猪进行育种。各科研院所也制备了数十种基因编辑动物模型。

2.1 锌指核酸酶技术在基因编辑猪上的应用

锌指核酸酶（Zincfingerproteins，ZFPs）又称锌指蛋白核酸酶（ZFPNs），是第一代人工合成的核酸内切酶。由锌指蛋白识别DNA与靶标结合，通过FokI内切酶对靶标进行切割，最终导致DNA双链断裂[1]。ZFN技术是第一种能够诱导非同源末端连接或同源重组途径的基因敲除或基因敲入技术，该技术打破了无法制备对特定基因进行编辑的基因编辑猪。2010年，Watanabe等用ZFN技术成功制备了基因编辑猪，这是首次利用ZFN技术得到的基因编辑猪[2]。2011年，Yang等利用ZFN技术制备了敲除PPAR-γ基因猪模型用来研究人的心血管疾病[3]。2013年，Kwon等利用ZFN技术制备了CMP-Neu5Ac基因编辑猪，为异种器官移植提供了一个良好的模型。在锌指核酸酶技术问世之初，曾被大量的优化和改造[4]，但由于构建步骤比较繁琐，耗时长，成本高，最终应用到基因编辑动物方面应用较少。

2.2 类转录激活因子核酸酶技术在基因编辑猪上的应用

类转录激活因子核酸酶技术（Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs）， 俗称TALEN，是第二代人工合成核酸内切酶。它是由可识别靶标的TAL效应因子与FokI内切酶组合而成，可对靶标实行定点修饰[5]。与ZFN技术累似，通过蛋白识别DNA序列，利用FokI内切酶对基因组进行剪切。相比ZFN技术，TALEN技术应用更为广泛，且效率高[6]。因此，TALEN技术在猪上的应用相对较多。2012年，Carlson利用TALEN技术获得了LDL受体基因编辑猪，为家族性高胆固醇血症提供了医疗研究模型[7]。2014年，Huang等利用TALEN技术制备了RAG1/2基因敲除猪，成功制备了重症免疫缺陷猪模型[8].2014年，赖良学实验室人员利用TALEN技术在Rosa26位点成功制备了基因敲入工猪模型，用以追踪猪细胞谱系[9]。虽然TALEN技术相比ZFN技术构建容易，但TAL蛋白无法识别一些特定的序列，且工作量较大，这使得TALEN技术在制备基因编辑猪上有一定的限制。

2.3 CRISPR/Cas9系统在基因编辑猪上的应用

CRISPR/Cas9是第三代人工核酸内切酶，与ZFN技术和TALEN技术最大区别在于识别靶标不同，CRISPR/Cas9是通过向导RNA与靶标互补配对，招募Cas9蛋白对基因组进行切割[10]。CRISPR/Cas9自2003年问世以来，被世界各地大小实验室广泛使用，相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9系统操作更为简单快速、成本低和效率高，很有可能完全取代ZFN技术和TALEN技术。经过几年的发展和改进，CRISPR/Cas9系统犹如“上帝的手术刀”，在农业，医疗和临床等诸多领域都体现出是一种前所未有的分子生物学研究手段的革新技术。

2.3.1 基因编辑猪应用到猪育种

基因编辑猪育种能够对猪进行快速的遗传改良，短时间内就能够获得自然状态下经过长期自然选择才能获得的表型。2015年，Wang等利用CRISPR/Cas9技术获得了MSTN基因敲除猪，阳性猪出现了明显的双肌臀表型[11]。MSNT基因突变表现双肌臀的现象在自然环境中需要经过长期的自然选择才能获得，然而通过基因编辑技术，在短短的几个月就能获得大量的突变群体，极大地缩短了猪育种进程。2017年，Burkard等人利用CRISPR/Cas9技术敲除猪蓝耳病受体CD163基因的一个结构域，最终实验证明敲除猪能够抵抗猪蓝耳病毒的感染[12]。自此之后，多家育种公司和科研院所开启了抗猪蓝耳病基因编辑猪育种，并成功获得了抗猪蓝耳病猪群体。2017年，Zhang等利用CRISPR/Cas9技术培育出了基因编辑抗寒猪，研究人员将小鼠的UCP1基因定点敲入到猪的基因组中，实现了UCP1基因在猪白色脂肪组织的特异表达，减少脂肪沉积，增加瘦肉率，同时提高了猪的抗寒能力[13]。2018年，周琪院士和王皓毅研究员团队利用CRISPR-Cas9技术制备了IGF2基因第三个内含子一个保守的SNP位点编辑巴马猪。与野生型巴马猪相比，IGF2基因编辑猪表现出体重、胴体重和瘦肉率等方面都显著提高[14]。2018年，Zhang等利用CRISPR/Cas9技术将四个来自微生物的酶类基因转入猪基因组中，培育出污染显著减少、节约粮食且生长快速的基因编辑猪[15]。

2.3.2 基因编辑猪应用到医疗模型

基因编辑猪疾病模型的建立主要是为了研究人类疾病。除了猪以外，模式动物小鼠也是一种很好的人类疾病模型。与小鼠相比，猪的习性，器官和组织等与人类具有较高的相似性，因此猪作为疾病模型研究人类疾病是比较理想的模型。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技术制备了vWF基因敲除猪，获得了血友病基因编辑模型猪[16]。同年，Peng等利用CRISPR/Cas9技术将人白蛋白基因定点敲入猪的基因组中，从而达到能够从猪的血清中获得人的白蛋白[17]。2015年，Chen等利用该技术获得了B细胞缺陷型基因编辑猪[18]。2018年，Yan等首次利用CRISPR/Cas9技术和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪。它能精准地模拟出人类神经退行性疾病，为治疗“亨廷顿舞蹈病”、老年痴呆等疾病提供了理想的动物模型[19]。

2.3.3 基因编辑猪应用到异种器官移植

与其他模式动物相比，猪的生理特征更与人类相似，尤其是器官大小与功能非常接近。因此通过制备基因编辑猪，对异种器官移植研究具有重要价值。2014年，Sato等利用CRISPR/Cas9系统敲除猪的α-GalT基因，消除了猪和人的异种器官移植的排斥问题，为人类器官移植探究提供了很好的模型[20]。2015年，哈佛大学和eGenesis公司的Yang等研究人员利用CRISPR/Cas9技术，敲除了猪内源的PERVs基因，解决了猪器官用于人体移植的重大难题[21]。

3 问题与展望

基因编辑技术的出现是现代分子生物学技术的一大飞跃，每一代新的核酸内切酶的出现都会带来极大的突破，使得制备基因编辑动物的主要困难不再受技术因素的制约。如今，科研人员很容易能够获得理想的基因编辑动物模型，从模式动物的小鼠到猪，羊和牛等大的哺乳动物，甚至灵长类的基因编辑猴子。然而，一个强大的技术往往都伴随有致命的缺点，限制基因编辑动物发展的最大缺点是脱靶问题。所谓脱靶就是在对靶基因进行剪切的同时，往往可能在生物体基因组的未知区域进行剪切，而且很难进行检测，最终可能造成细胞毒性。若是基因编辑动物出现脱靶现象，可能对动物个体造成无法预测的表型。迄今为止，制备的基因编辑猪均没有进行过系统的脱靶检测，即使外观，生理生化指标等检测正常，但基因组某些区域是否被剪切仍是未知。

制备基因编辑猪最常用到的是体细胞核移植技术，目前该技术最大的缺点仍然是效率很低。虽然通过直接注射受精卵的效率相对较高，但是获得的F0代基因编辑猪大多数都是嵌合体，为了获得纯合子，需要经过配种扩群。因此，制备基因编辑猪的成本仍然是很高的，制约了规模化养殖的进程。

转基因食品安全性是制约基因编辑动物推广的最大制约因素。理论上基因编辑动物不属于转基因范畴，很多基因编辑动物是模仿自然突变，只是通过人为手段较快地获得突变个体。近几年，转基因三文鱼和基因编辑蘑菇相继上市，说明了人们对转基因食品逐渐变得越来越认可。各个国家也根据本国的国情制定了相应的评价标准和体系，相信在不久的将来转基因食品都能被公众所认可。

基因编辑技术革新了分子生物学的研究手段，为动物育种，疾病治疗和临床应用带来了前所未有的希望。在科研人员的不断探索和努力下，基因编辑技术体系会不断地得到完善，新的基因编辑技术也会相继被挖掘，希望最终能够使基因编辑技术被广泛应用到多种领域中。

参考文献略。（如有需要请与作者联系。）