肠道微生态对肝硬化-肝癌癌前病变恶性转变的影响

王 轲，李京涛，闫曙光，魏海梁，鞠 迪，冯飞雪，郭英君，常占杰

1.陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳712000； 2.陕西中医药大学附属医院； 3.宁夏自治区人民医院

肠道菌群是寄居在人体肠道内数以万亿的微生物。目前广泛认为肠道菌群的组成和代谢能力有助于调节宿主的代谢功能，促进免疫系统的发育与成熟，并能影响宿主的生理、病理变化，调控疾病的发生、发展等。同时，由于肠道微生物庞大的多样性，又容易受到宿主遗传、饮食、环境等因素的影响，所以，不同宿主和不同疾病在菌群组成上的动态变化差异巨大。

“肝炎-肝硬化-肝癌”是肝病进展的“三部曲”。在肝硬化-肝癌的恶变进程中，会经历一个较长的肝癌癌前病变过程[1-2]。肝癌癌前病变是良性病变向恶性病变过渡的移行阶段，是一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，持续时间较长。肝硬化-肝癌癌前病变恶性转变促进肝癌的发生、发展，但如果及时去除病因或适当治疗，这个恶变过程就可能停止甚至恢复。慢性肝病持续进展会伴随肠道微生态平衡的不同变化，同时，肝脏生理功能的改变也会诱导肠道微生态发生变化[3]，例如临床上肝硬化患者常常并发自发性细菌性腹膜炎等。深入探讨两者之间的相互作用关系，将有助于进一步了解肝癌的发生机制，并为预防和干预肝癌发生提供新的思路和治疗靶点。

1 肠道微生态和肝脏的关系

肝脏70%的血供来自门静脉，这些门静脉系统的血液富含营养，同时也存在大量的肠源性毒素和微生物代谢物(LPS、鞭毛蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖)。这些微生物的产物不断涌入肝-肠循环，是目前公认的肠道菌群和肝脏之间的联系。肝脏含有丰富的免疫细胞，如自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、Kupffer细胞和肝星状细胞(HSC)。在正常情况下，少量的细菌或细菌代谢产物进入肝脏，均被活化的Kupffer细胞及自身免疫系统消除。而当肠黏膜屏障破坏，肠道炎症或门静脉高压时，大量的细菌和细菌代谢物涌入肝脏，刺激肝细胞损伤并激活肝脏免疫应答机制，从而影响慢性肝病的进展[3-4]。

1.1肠道菌群的组成肠道与宿主共生的细菌数量巨大，例如成人肠道中定植着约4×1013个微生物[5]，这些微生物与人体共生并相互作用。了解肠道菌群的组成，将有助于深入研究肠道微生态与宿主疾病之间的相关性。目前研究肠道菌群的方法主要有两种：基于微生物培养的方法和非微生物培养的方法。微生物培养技术是研究肠道菌群组成的主要方法，但缺点是目前仅有30%的肠道微生物可以被培养，而剩下70%的肠道微生物，由于在体外难以提供有利于它们生长的培养条件，也可能由于菌群之间复杂的共生关系，致使难以培养并用来综合分析[4,6]。分子生物学技术是另一大类可用于肠道微生物全基因组分析的方法，包括实时PCR、基因芯片和焦磷酸测序技术等，可用于微生物多样性与定量化分析[7]。基于16SrRNA基因[8]测序法是目前最常用的DNA基因库测序方法，对肠道菌群具有较高的综合分析分辨率和精确量化。根据肠道微生物对人体的影响，可将其分为：有害菌(如葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭杆菌)、有益菌(如乳酸杆菌、双歧杆菌)和中间菌(如肠杆菌、肠球菌、拟杆菌)。CLAESSON等[9]对肠道菌群组成研究发现，拟杆菌门是最主要的菌种，平均比例为57%，其次是厚壁菌门，平均比例为40%。个体之间的细菌组成差异明显，且随着年龄的变化，菌群组成也发生改变，例如：老年人肠道拟杆菌物种多样性增加，而双歧杆菌减少[10]。

1.2肠道细菌的易位细菌易位(BT)最早由Berg和Garlington提出，指活菌通过胃肠道上皮黏膜固有层，进入肠系膜淋巴结(MLN)和其它脏器[11]。肠源性细菌侵入肠系膜和淋巴结并随静脉血流进入肝脏而影响到肝脏的功能。在健康人体内，上皮屏障和肠系膜屏障的免疫功能可以杀死少量转移菌。当人体正常生理功能发生改变，可加剧肠道细菌的易位、繁殖并入侵肠系膜淋巴结，通过“肝-肠循环”而影响肝脏功能[12]。其中活动频繁的有肠杆菌、肠球菌、变形杆菌，专性厌氧菌属则很少穿透胃肠屏障。活菌易位可诱发“自发性”细菌感染，产生促炎细胞因子和释放NO，从而发生一系列“病理”改变[13]。肠道内细菌易位会导致小肠内厌氧菌群数量增多或种类改变，表现为小肠细菌过度生长，使胆酸、胆盐、胃酸及胃肠节律运动、黏液流动、更新脱落、肠腔电位和黏膜分泌(抗体免疫物质、消化酶)等调节发生改变，临床上有腹胀、腹泻、小肠动力异常及营养吸收不良等综合表现[14-15]。

1.3肠黏膜屏障的破坏肠黏膜屏障具有防止肠道内有害物质如细菌和LPS等穿透肠黏膜的功能。导致肠通透性增加的原因很多，而大多是由于肠内细菌的氧化应激和代谢产物刺激肠上皮细胞破坏[16]。肠上皮细胞在宿主肠道微生态的免疫系统中起核心作用，并影响细胞内、外双向信息的传递[17-18]。如果上皮细胞没有受损，少量细菌易位及其代谢产物可穿过上皮细胞，经淋巴液流向肠系膜淋巴结通过自身免疫减少对机体的影响；如果上皮细胞受损，肠道微生物、LPS或抗原等大分子有毒物质可通过受损的肠上皮细胞直接进入血液，经体循环进入门脉系统而引起肝损伤[18]。肠道菌群的改变使得在细菌、LPS等刺激下发生肠黏膜下水肿、肠绒毛顶部细胞坏死，通透性增加；另外，来自肝源性炎症因子通过破坏的肠上皮细胞，可进一步增加肠道黏膜通透性，促进细菌及其代谢产物进入门脉系统[19]，如此形成恶性循环，促使肝脏损伤持续进展。

2 肠道微生态失衡促进肝硬化-肝癌癌前病变的恶性转变

目前肝硬化-肝癌癌前病变的恶性转变的机制尚不完全清楚，公认的机制主要包括以下3个方面：(1)肝癌癌前病变细胞的产生是导致肝癌发生的始动因素(种子)；(2)炎症纤维化微环境是肝癌形成的促进因素(土壤)；(3)肝癌癌前病变细胞与炎症纤维化微环境的相互作用则加速了肝癌的最终形成。

在肝硬化阶段，肝细胞大量受损，为了促进肝脏的修复，肝细胞通过有丝分裂加速增殖，细胞更新周期加快，而在病毒感染、有毒物质(如酒精、黄曲霉毒素、细菌LPS等)因素刺激下，处于有丝分裂期的肝细胞易发生DNA突变，而异常的肝细胞再生干扰了DNA损伤的修复，导致DNA突变传给子代细胞，并在子代细胞中稳定表达。肝细胞基因变异的蓄积，促使肝细胞或干细胞转化为肝癌癌前病变细胞[20-21]。肠道中革兰氏阴性菌产生大量LPS，其在内毒素结合蛋白(LBP)的参与下，与巨噬细胞膜CD14受体结合，继之，协同蛋白MD-2辅助，使其与TLR4/MD-2复合物相互识别[22]，并激活下游相应的信号传导途径，其中包括MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径[23-25]。在肝癌癌前病变细胞的产生过程中主要与MyD88依赖途径有关，TLR4胞内区的TIR结构，与MyD88的C端TIR结构域识别并结合，然后依次募集并活化MyD88下游的接头蛋白TRAF6、IRAK-4、TAK1，其中，TAK1可进一步激活IKK-NF-κB信号途径，促使NF-κB相应部位磷酸化、核转移，使促炎性因子基因活化[22,25]，表达强大的促炎性细胞因子如：TNF-1α、IL-1β、IL-6和IL-12，而在应答后期，IL-10和TGF-β通过MyD88/NF-κB信号传导途径也刺激肿瘤生长细胞因子活化[26-27]，并与大量的炎性因子一同干预肝细胞DNA损伤的修复，导致突变的DNA持续产生并遗传给子代细胞，从而促使肝癌癌前病变细胞的产生。

临床中发现肝纤维化和肝硬化患者的肠道细菌组成也异于常人[28]，有报道[29]采用16SrRNA V3区焦磷酸测序和实时PCR检测技术，发现肝纤维化患者肠道中拟杆菌门减少而变形杆菌和梭杆菌显著增加，且随着毒性代谢产物及LPS释放的增多，肝纤维化的程度也随之加重[30-31]。肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化发生、发展的中心环节[28,32]，而HSC上的TLR4对LPS敏感，通过LPS-TLR4通路，可直接作用并刺激HSC使内皮素-1(ET-1)释放增多，ET-1与ET受体结合激活促有丝分裂蛋白酶的表达，从而促使静止期的HSC活化和增殖，促进肝脏纤维化的进展[33-34]。同时，LPS也通过TLR4-MyD88-NF-κB信号传导途径，致使大量炎性因子释放并能不断刺激活化HSC，产生大量纤维胶质，加重炎症纤维化的发生、发展[35]。活化的HSC一方面通过增殖和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，通过细胞收缩使肝窦内压升高，最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础[36-38]；另一方面活化的HSC经MyD88-NF-κB信号通路表达大量TGF-β，TGF-β的过表达影响损伤肝细胞的再生和修复，加剧肝纤维化[39]；大量释放的TGF-β又进一步刺激活化HSC，如此形成了恶性循环[35,40]。HSC活化是炎症纤维化发生、发展的中心环节，肠道微生态失衡导致的LPS大量释放是促使HSC活化的重要原因之一。

3 展望

综上所述，肝癌癌前病变的发生与肠道微生态失衡关系密切。肝硬化基础上，肝细胞在肠道来源的大量LPS的刺激下，通过多重信号传导途径，促使大量炎性因子的表达释放，一方面可干扰损伤肝细胞正常再生修复，使其易发生DNA突变，并稳定遗传给子代细胞，促使肝癌癌前病变细胞的发生；另一方面，大量的炎性因子释放又不断刺激并活化HSC加剧炎症纤维化的发生、发展。而肝癌癌前病变细胞的产生和炎症纤维化微环境的形成相互作用，促使肝癌癌前病变的恶性转变。所以，通过调节肠道菌群的组成、阻止细菌易位和阻断相关信号通路等，可能能够阻止或延缓肝癌癌前病变的形成和恶性转变。目前在人体内有关肝癌癌前病变与肠道微生态的机制研究相对较少，基础研究的进展和成果的临床转化，可能会为临床肝癌的防治工作提供新方法、新药物和新技术。

[1] DI TOMMASO L, SANGIOVANNI A, BORZIO M, et al. Advanced precancerous lesions in the liver [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2013, 27(2): 269-284. DOI: 10.1016/j.bpg.2013.03.015.

[2] 何玲玲, 赵亚林, 杜林林, 等. 肝结节性病变的病理和影像学表现[J]. 临床肝胆病杂志, 2015, 31(9): 1547-1550. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2015.09.047.

HE L L, ZHAO Y L, DU L L, et al. Research advances in pathological and imaging manifestations of hepatic nodular lesions [J]. J Clin Hepatol, 2015, 31(9): 1547-1550. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2015.09.047.

[3] MINEMURA M, SHIMIZU Y. Gut microbiota and liver diseases [J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(6): 1691-1702. DOI: 10.3748/wjg.v21.i6.1691.

[4] LAGIER J C, MILLION M, HUGON P, et al. Human gut microbiota: repertoire and variations [J]. Front Cell Infect Microbiol, 2012, 2: 136. DOI: 10.3389/fcimb.2012.00136.

[5] SENDER R, FUCHS S, MILO R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans [J]. Cell, 2016, 164(3): 337-340. DOI: 10.1016/j.cell.2016.01.013.

[6] TILG H, CANI P D, MAYER E A. Gut microbiome and liver diseases [J]. Gut, 2016, 65(12): 2035-2044. DOI: 10.1136/gutjnl-2016-312729.

[7] BIAGI E, CANDELA M, FAIRWEATHER-TAIT S, et al. Ageing of the human metaorganism: the microbial counterpart [J]. Age (Dordr), 2012, 34(1): 247-267. DOI: 10.1007/s11357-011-9217-5.

[8] RAZZAUTI M, GALAN M, BERNARD M, et al. A comparison between transcriptome sequencing and 16S metagenomics for detection of bacterial pathogens in wildlife [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2015, 9(8): e0003929. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003929.

[9] CLAESSON M J, CUSACK S, SULLIVAN O, et al. Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108 Suppl 1: 458-4591. DOI: 10.1073/pnas.1000097107.

[10] GOLDBERG E, AMIR I, ZAFRAN M, et al. The correlation between Clostridium-difficile, infection and human gut concentrations of Bacteroidetes phylum and clostridial species [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(3): 377-383. DOI: 10.1007/s10096-013-1966-x.

[11] BENTEN D, WIEST R. Gut microbiome and intestinal barrier failure -the “Achilles heel” in hepatology? [J]. J Hepatol, 2012, 56(6): 1221-1223. DOI: 10.1016/j.jhep.2012.03.003.

[12] CUENCA S, SANCHEZ E, SANTIAGO A, et al. Microbiome composition by pyrosequencing in mesenteric lymph nodes of rats with CCl4-induced cirrhosis [J]. J Innate Immun, 2014, 6(3): 263-271. DOI: 10.1159/000356454.

[13] WIEST R, LAWSON M, GEUKING M. Pathological bacterial translocation in liver cirrhosis [J]. J Hepatol, 2014, 60(1): 197-209. DOI: 10.1016/j.jhep.2013.07.044.

[14] 高晓, 马英杰, 魏新朋. 小肠细菌过度生长与肝病关系的研究进展[J]. 临床医学, 2015, 35(9): 119-122.

[15] KRAJICEK E J, HANSEL S L. Small intestinal bacterial overgrowth: a primary care review [J]. Mayo Clin Proc, 2016, 9(12): 1828-1833. DOI: 10.1016/j.mayocp.2016.07.025.

[16] GOYAL A, GHOSHAL U C, AHAMAD I, et al. Frequency and factors associated with increased small intestinal permeability in patients with portal hypertension [J]. Trop Gastroenterol, 2013, 34(3): 136-143.

[17] KAYAMA H, TAKEDA K. Functions of innate immune cells and commensal bacteria in gut homeostasis [J]. J Biochem, 2016, 159(2): 141-149. DOI: 10.1093/jb/mvv119.

[18] DE VOS M, DE VROEY B, GARCIA B G, et al. Role of proton pump inhibitors in the occurrence and the prognosis of spontaneous bacterial peritonitis in cirrhotic patients with ascites [J]. Liver Int, 2013, 33(9): 1316-1323. DOI: 10.1111/liv.12210.

[19] MORI K, SUZUKI T, IGARASHI T, et al. Persistent hyperglycemia modulates gut immune function and microbiota in rats [J]. J Intensive Care, 2015, 3(1): 34. DOI: 10.1186/s40560-015-0101-8.

[20] KEW M C. The role of cirrhosis in the etiology of hepatocellular carcinoma [J]. J Gastrointest Cancer, 2014, 45(1): 12-21. DOI: 10.1007/s12029-013-9556-9.

[21] WHITTAKER S, MARAIS R, ZHU A X. The role of signaling pathways in the development and treatment of hepatocellular carcinoma [J]. Oncogene, 2010, 29(36): 4989-5005. DOI: 10.1038/onc.2010.236.

[22] KIZILTAS S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases [J]. World J Hepatol, 2016, 8(32): 1354-1369. DOI: 10.4254/wjh.v8.i32.1354.

[23] TANIMURA N, SAITOH S, OHTO U, et al. The attenuated inflammation of MPL is due to the lack of CD14-dependent tight dimerization of the TLR4/MD2 complex at the plasma membrane [J]. Int Immunol, 2014, 26(6): 307-314. DOI: 10.1093/intimm/dxt071.

[24] CHEN P, XIE L X. Signal transduction pathways mediated by Toll-like receptors and their relations with fungal keratitis [J]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi, 2012, 48(1): 80-84.

[25] ZOU Y, QIN F, CHEN J, et al. sTLR4/MD-2 complex inhibits colorectal cancer in vitro and in vivo by targeting LPS [J]. Oncotarget, 2016, 7(32): 52032-52044. DOI: 10.18632/oncotarget.10496.

[27] XIA M Z, LIANG Y L, WANG H, et al. Melatonin modulates TLR4-mediated inflammatory genes through MyD88- and TRIF-dependent signaling pathways in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells [J]. J Pineal Res, 2012, 53(4): 325-334. DOI: 10.1111/j.1600-079X.2012.01002.x.

[28] GOYAL A, GHOSHAL U C, AHAMAD I, et al. Frequency and factors associated with increased small intestinal permeability in patients with portal hypertension [J]. Trop Gastroenterol, 2013, 34(3): 136-143.

[29] CHEN Y, YANG F, LU H, et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis [J]. Hepatology, 2011, 54(2): 562-572. DOI: 10.1002/hep.24423.

[30] RAI R, SARASWAT V A, DHIMAN R K. Gut microbiota: its role in hepatic encephalopathy [J]. J Clin Exp Hepatol, 2015, 5(1): 29-36. DOI: 10.1016/j.jceh.2014.12.003.

[32] 吴玉婧, 郭津生. 肝脏炎症及纤维化微环境与肝癌发生关系的研究进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2014, 22(2): 156-158. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2014.02.019.

WU Y J, GUO J S. An inflammatory and fibrotic microenvironment promotes hepatocellular carcinogenesis [J]. Chin J Hepatol, 2014, 22(2): 156-158. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2014.02.019.

[33] CHASSAING B, ETIENNE-MESMIN L, GEWIRTZ A T. Microbiota-liver axis in hepatic disease [J]. Hepatology, 2014, 59(1): 328-339. DOI: 10.1002/hep.26494.

[34] LIU C, CHEN X, YANG L, et al. Transcriptional repression of the TGF-β pseudoreceptor BAMBI by NF-κB p50 enhances TGF-β signaling in hepatic stellate cells [J]. J Biol Chem, 2014, 289(10): 7082-7091. DOI: 10.1074/jbc.M113.543769.

[35] YOSHIDA K, MURATA M, YAMAGUCHI T, et al. Reversible human TGF-β signal shifting between tumor suppression and fibro-carcinogenesis: implications of smad phospho-isoforms for hepatic epithelial-mesenchymal transitions [J]. J Clin Med, 2016, 5(1): E7. DOI: 10.3390/jcm5010007.

[36] GUPTA D K, SINGH N, SAHU D K. TGF-β mediated crosstalk between malignant hepatocyte and tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Growth Metastasis, 2014, 7(7): 1-8. DOI: 10.4137/CGM.S14205.

[37] 朱宏斌, 杨云生, 郭明洲. 肝癌中转化生长因子(TGF)-β信号转导通路的研究进展[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2012, 21(3): 206-209. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2012.03.003.

ZHU H B, YANG Y S, GUO M Z. Transforming growth factor β (TGF-β) and hepatocellular carcinoma [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2012, 21(3): 206-209. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2012.03.003.

[38] KARSDAL M A, MANON-JENSEN T, GENOVESE F, et al. Novel insights into the function and dynamics of extracellular matrix in liver fibrosis [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2015, 308(10):G807-G830. DOI: 10.1152/ajpgi.00447.2014.

[39] YOSHIDA K, MURATA M, YAMAGUCHI T, et al. TGF-β/Smad signaling during hepatic fibro-carcinogenesis (review) [J]. Int J Oncol, 2014, 45(4): 1363-1371. DOI: 10.3892/ijo.2014.2552.

[40] KATZ L H, LI Y, CHEN J S, et al. Targeting TGF-β signaling in cancer [J]. Expert Opin Ther Targets, 2013, 17(7): 743-760. DOI: 10.1517/14728222.2013.782287.