幽门螺旋杆菌候选疫苗抗原的研究进展①

赵 翠 赵福广 黄利亚

(吉林农业大学生命科学学院，长春 130118)

1 前言

HP是一种螺旋形，寄居于人胃黏膜上的一种革兰氏阴性微需氧菌，对生长条件要求十分苛刻。HP不依赖组织入侵的方式定植于胃上皮黏膜，这在很大程度上有利于逃避宿主免疫机制，同时，HP有整合环境DNA的能力，这种能力增加了HP在变化的环境中得以生存的机会[1]。HP感染后的临床表现多样性提示了HP致病机制的复杂性。在与疾病的相关性方面，HP是慢性胃炎、十二指肠溃疡等的主要致病菌，且与胃癌、胃黏膜相关淋巴组织(Mucosa associated lymphoid tissue,MATL)恶性淋巴瘤的发生有密切联系。最近的研究表明[2]，HP与神经退行性疾病的关联性呈上升趋势，此外在多发性硬化患者中HP检出率极低，推测HP可能是发展多发性硬化的保护因子[3]。在对HP疫苗的探究过程中，围绕全菌体抗原进行的攻毒试验获得了较为理想的免疫保护率，但因其成分复杂，安全性差等缺点，将其作为疫苗应用于人体，还需进一步研究。因此，研制一种经济、高效、安全的治疗性疫苗是防治HP感染的有效途径，而筛选高效抗原又是疫苗研制工作的重中之重，本文就HP疫苗的候选抗原的研究近况及发展前景作一综述。

2 抗原研究进展

2.1尿素酶 尿素酶(Urase)位于细菌表面，包括UreA和UreB两个结构基因，其丰富的蛋白含量约占全菌蛋白的5%～10%。在HP的致病机制方面，尿素酶主要通过水解尿素产生氨和二氧化碳，调节细菌细胞周围的pH值，是HP在高强度胃酸中得以生存和定植的关键[4]，同时尿素酶是HP重要的定植因子和毒力因子，因此，“无酸无溃疡”的传统观点已经被打破。

目前，对尿素酶的研究比较广泛，秦玉红等[5]将纯化的rUreB蛋白加弗氏佐剂经腹腔注射免疫小鼠，可诱导产生高水平的特异性抗体，测得小鼠血清中的IgG抗体水平较对照组相比显著增加，同样的结果体现在Zhang等[6]的研究中。随着研究的深入，研究者们发现将尿素酶和其他能诱导机体产生免疫保护作用的抗原联合制成二价或多价疫苗，可能会进一步增强疫苗的免疫效果。林焕建等[7]通过UreB和过氧化氢酶加免疫佐剂CT制成二价口服疫苗，获得了近83.4%的免疫保护率，与单价疫苗组即过氧化氢酶加CT组的41.7%和UreB加CT组的54.2%相比获得了较为理想的免疫效果，且二价疫苗组中小鼠胃黏膜中HP的定植密度也明显降低。更多可喜的研究结果体现在Zhou等[8,9]的研究中。

虽然不同地区的HP菌株具有多样性和易变异等特点，但不同HP菌株间UreB的核酸序列具有高度的保守性和同源性，且分子量大，特异性强，能有效地诱导机体产生稳定的免疫保护作用，与UreA相比，UreB具有更好的免疫保护作用[10]。因此，UreB被列为最有前景的候选抗原之一。

2.2空泡毒素和细胞毒素

2.2.1空泡毒素 空泡毒素相关基因A (Vacuolat-ing cytotoxin gen A，VacA)编码的VacA蛋白是HP中重要的毒力因子和致病因子。有研究表明，VacA和CagA基因的可变序列可能是HP菌株多样性和易变异的主要原因。目前，根据VacA和CagA的表达情况，可将HP分为两类：Ⅰ型(CagA+VacA+)和Ⅱ型(CagA-VacA-)。

VacA是一种约含有860个氨基酸残基的多功能蛋白，该毒素通过在靶细胞膜上形成小孔，导致细胞中离子和小分子物质泄漏。VacA最重要的生物学作用是诱导宿主细胞的细胞膜孔隙与空泡的形成，诱导上皮细胞空泡样损伤[11]。Chiozzi等[12]研究表明：VacA可诱发炎症反应，而VacA与氯化铵联合作用，在诱发炎症反应的同时，还可使人胃上皮细胞加速凋亡。Hasanzadeh等[13]将VacA的抗原区克隆到载体PET32a中，并在大肠杆菌BL21中表达目的蛋白，结果表明VacA蛋白不但具有抗原性，且重组VacA蛋白能够与HP患者血清中IgG特异性识别。由以上结果不难看出VacA作为HP疫苗候选抗原的潜力，并推测VacA可以用于HP诊断试剂和HP疫苗的发展，但VacA单独作为抗原对小鼠进行攻毒试验并评价免疫效果的研究很少，一般是与细胞毒素相关基因A或其他抗原联合应用。

2.2.2细胞毒素 细胞毒素相关基因A(Cytotoxin-associated gen A，CagA)的表达产物CagA蛋白是一种免疫原性较强，存在于菌体表面的外膜蛋白。CagA基因5′端高度保守，不同毒力菌株之间的同源性高达80%以上，可以作为候选抗原刺激机体产生免疫反应，与此相反的CagA基因3′端相对多变，含有不同数量的重复序列。CagA是HP中能增强胃炎、消化性溃疡的一种重要的毒力因子，还可能是胃上皮细胞癌变的关键因素[14]。据早些年研究表明[15]，CagA阳性菌株常见于炎症较为严重或胃癌患者中，这些患者胃上皮细胞中的AP-1和NFKB等转录因子活性升高，其激活可导致多种炎症因子如IFN-γ、IL-2等的表达，从而加剧胃黏膜损伤。再者，T细胞的FasL基因启动子区域有2个NF-κB和3个AP-1结合位点，CagA可能通过激活转录因子增强T细胞FasL基因的表达，损害Fas阳性上皮细胞，促进T细胞间“相互残杀”。因此以上研究并不支持CagA用于候选抗原的应用。但随着研究的深入，发现CagA基因完整的DNA序列因其含有非必需表位和较高分子质量，不易克隆和表达。因此，研究者们选择将CagA部分基因序列与其他抗原联合，制备二价甚至多价疫苗，并在动物模型中取得了较为可喜的成果，同时开启了由HP单价疫苗转向多价疫苗的时代[16,17]。

近些年来，对VacA和CagA的研究仅限于动物模型，鲜有VacA和CagA疫苗进入临床试验的相关报道，但对二者的研究热度并没有因此而减少。由于多抗原融合疫苗参与发病的不同阶段，因而获得了较为理想的免疫效果，为HP多价疫苗的发展提供一定的理论支持，HP多价疫苗可能是攻克HP感染道路上的成功一步。

2.3黏附素 黏附素(Helicobacter pylori adhesin A，Hpa A)是由Hpa A基因编码的脂蛋白，不同HP菌株间高度保守，迄今为止，并没有发现Hpa A阴性菌株。Hpa A介导HP的黏附与定植，具有较好的免疫原性和免疫反应性，但发挥免疫保护作用的关键表位和分子机制尚不明确。有研究表明，Hpa A由胞内区、跨膜区、胞外区三个部分组成，其中跨膜区和胞外区发挥免疫保护作用[18]，因此，Flach等[19]利用截短形式的HpaA联合UreB免疫C57BL/6小鼠，与对照组全长的Hpa A联合UreB相比较，HP特异性抗体IgG的滴度显著升高。近期，Tobias等[20]构建重组无毒的霍乱弧菌，将Hpa A和产肠毒素大肠杆菌定植因子(CFA/I)共表达(VC-HpaA-CFA/I)，发现与VC-HpaA相比，Hpa A水平在重组菌株VC-HpaA-CFA/I中的表达量更高，理论上，此种疫苗可以对抗包括大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌在内的三种病原体，可能成为抗HP感染的潜在候选疫苗，为今后研制对抗多种病原体疫苗提供更多的理论支持，但此疫苗的安全性有待进一步评估。

2.4过氧化氢酶 过氧化氢酶(Catalase，KatA)是一种高度保守，暴露于菌体表面的蛋白酶，约占HP菌体蛋白的1.5%左右。在功能上KatA与Urase似乎有着异曲同工之妙，KatA通过将有毒的代谢产物转化成水，保证代谢平衡的同时，保护HP免受中性粒细胞杀伤，是HP逃避宿主免疫的重要组成部分。同时KatA在pH<3的环境中仍可保持活性，是HP在胃黏膜极酸环境中得以定植和生存的关键。近些年，关于KatA表位疫苗的研究较多，并证实含有较少氨基酸序列的KatA表位疫苗等同甚至优于KatA全序列疫苗[21,22]。随着研究的深入，KatA抗原与疾病的关联程度备受关注，尤其是在胃癌中。有研究表明[23]，较高的KatA抗体滴度在一定程度上可以预防胃癌的发生，并可以作为胃癌筛选的生物标志物。经查阅文献可以看出，在2010年甚至更早以前涌现了大量关于证实KatA免疫原性的研究[24,25]，为KatA作为HP疫苗候选抗原、KatA联合其他抗原、KatA表位疫苗的发展提供理论依据。虽然表位疫苗的表位识别和正确组装技术尚不成熟，表位之间的相互影响仍需探索，但KatA表位疫苗已经展现了不俗的发展前景，这为探究HP疫苗的大方向奠定基础。

2.5膜炎性蛋白 膜炎性蛋白(Outer inflammatory protrin,OipA)由hopH基因编码，相对分子质量约34 kD。关于OipA与临床疾病的关系尚无统一定论，有研究发现，在胃溃疡患者中OipA+HP的总检出率高达100%，显著高于胃炎患者26.2%的检出率。相似的结果也体现在Markovska等[26]的研究中，OipA几乎表达于从消化性溃疡患者分离的所有菌株中(97%)，在胃炎患者中分离的菌株中较少(66%)。但在最近的研究却展现相反的结果，OipA与胃部疾病无关联，不能作为预测诊断胃肠疾病的标志[27]。

目前，对于OipA能否直接影响促炎性信号还存在争议，有研究表明，功能性的hopH基因失活导致IL-8分泌减少50%左右，因此功能性的OipA在IL-8的诱导中起着重要作用。与此相反，在Dossumbekova等[28]的研究中发现hopH基因表达与IL-8分泌并没有相关性。出现上述两种结果的原因可能是菌种的区域性差异，因此，不同地理区域的临床报告预测毒力因子与疾病的发生结果是有争议的。

2.6十二指肠溃疡促进因子 DupA(Duodenal ulcer promoting gene，DupA)被称为十二指肠溃疡促进因子，因常见于十二指肠溃疡患者中而得名。DupA是近些年研究的热门，因此，围绕DupA的相关研究并不完善，研究结果不尽相同甚至相反。有研究表明[29]，不同区域DupA阳性检出率不同，且与临床疾病无显著相关性，该研究还发现，DupA的存在与否与HP的其他毒力因子无关。同年Shiota等[30]表明，DupA与十二指肠溃疡密切相关，但与胃癌的关系尚不明确。近年来Souod等[27]通过研究DupA、OipA与胃部疾病的关系中指出，DupA可以作为预测十二指肠溃疡的标志物和胃癌的抑制因子，同时发现HP中的一些毒力因子并不单独存在，而是与其他毒力因子联合形成“协同活性”，此研究结果与Shiota等[30]完全相反。最近，在探索HP中毒力因子与胃部疾病的关联性发现，HP中的毒力因子之间存在关联性(VacA、CagA、DupA、OipA)，这种关联性与胃部疾病联系紧密，特别是胃炎[31]。以上种种结果不难看出，虽然围绕DupA的相关研究日渐广泛，但关于DupA与临床疾病的关联性尚无统一定论，且目前并没有关于DupA作为候选抗原制成HP疫苗的相关报道。

2.7脂多糖 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是重要的毒力因子，被认为是引起黏膜炎症反应的一种强效内毒素，介导多种细胞因子和趋化因子的释放，从而诱导免疫反应的发生[32]。LPS主要表达LewisX和LewisY抗原决定簇，HP患者产生Lewis抗原决定簇抗体并通过自身免疫反应造成胃黏膜损伤和溃疡创面形成[33]。此外LPS促进Th1型免疫应答反应，并在受试小鼠体内检测到细胞因子IFN-γ增加，这可能是消除HP感染的关键[34]。在对此种抗原的学习和查阅文献中发现，LPS的研究现状处于探究其生物活性，评价免疫原性阶段，且对其引起免疫应答的类型处于研究探索中，因此，尚且没有LPS作为抗原或与其他抗原联合制备HP疫苗的相关报道。

3 前景展望

除上述几种抗原外，中性粒细胞激活蛋白(Nap)[35,36]、热休克蛋白(Hsp)[37,38]都有作为候选抗原的相关报道，在这里不再一一概述。就HP疫苗的研究现状而言，HP疫苗仍处于实验阶段，现阶段的研究成果尚不能完全清除体内感染和阻断HP传播，且保护率不高的问题在国内外一直未有突破。目前为止，尚且没有HP疫苗进入临床的相关报道，因此，现阶段的治疗方式仍以抗生素治疗为主，但抗生素耐药性(克拉霉素)成为应用抗生素治疗失败的主要原因[39]，基于目前理论研究成果，推荐使用益生菌[40,41]和中药制剂作为辅助治疗。

HP疫苗的研究尚存在许多问题，但取得的成果不容忽视，Naz等[42]基于反向疫苗学方法预测HP疫苗的潜在候选抗原，并预测VacA、BabA、Hpa A等是首要候选抗原。现如今，大部分的临床研究已经运用重组尿素酶作为抗原。或许研究不同抗原组合的多价疫苗、筛选高效抗原并增加抗原的表达量、探索HP表位疫苗中表位结合的新型方式是HP疫苗未来的发展方向。随着生物学、信息科学技术的不断发展和完善，HP疫苗的研制必将取得成功。

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