小鼠肠道菌群对外周免疫器官影响的研究进展①

薛淮娟 马 龙 秦 欢 姚新生

(遵义医学院免疫教研室，遵义 563000)

1 肠道菌群的存在方式及作用

肠道菌群作为目前热门的研究领域之一，在肿瘤的防治与研究、免疫系统相关疾病的发生与治疗、生活规律的形成影响及抑郁症的发生发展中，均被证实具有重要的诱导甚至参与主要的调控作用[1,2]。根据菌群对宿主的影响可大致分为：共生型、致病型、共生致病型。而体内如此多样功能各异的肠道菌群主要是由它们自身产生的蛋白质和代谢产物，通过直接或间接的方式相互协调相互作用，从而增强对宿主的防御以及提高营养的获得和保持在炎症环境下的持续存在[3]。但这些微生物很少作为单一的个体存在于体内例如浮游生物的形式，相反它们存在于被统称为生物膜的区域内，通过自己产生的聚合物基质从而避免遭受机体的免疫攻击。而每一个生物膜区内均含有数百个不同的微生物，其中具有毒性的细菌可以保护生物膜免受外界侵扰，而其他物种则主要为生物膜区获取相应的营养。随着生物膜区的形成和不断发展，会导致其内微生物的集体基因表达发生显著变化[4]。其中肠道病毒作为机体常见的感染源即可通过“跨界相互作用”与肠道微生物相互调控，并且越来越多的研究认为这一调控方式是导致疾病具有传染性、诱导性和调控性的关键点之一,例如小鼠乳腺肿瘤病毒可与革兰氏阴性菌表面的脂多糖结合，从而激活了宿主的先天免疫反应，导致机体对小鼠乳腺肿瘤病毒的复制和传播均表现为高度的耐受性[5]。而作为共生致病型微生物代表的大肠杆菌其可通过获取新基因，或通过丢失基因的方式改变目前的基因组从而改变自身功能机制并产生致病性的演变，从而以共生型和治病型两种不同形式存在于体内[4]。而肠道中具有重要调节作用的共生菌，其与机体相互依赖协调发展的基础，主要来源于宿主细胞和组织对共生菌所产生的免疫刺激途径的耐受能力，例如共生菌所携带的LPS可通过激活Toll样受体4途径，而Hennezel团队[6]发现机体肠道免疫系统对LPS所介导的TLR4信号保持沉默，主要存在于全部的拟杆菌及共生菌的部分非免疫结构特征中,并且证实LPS介导的免疫耐受是体内共有微生物的固有特征。

2 小鼠肠道菌群对肠道免疫系统的影响

机体黏膜表面是非自身抗原与机体相接触的第一道关卡，其中肠道已经发展成为独特的淋巴器官，并且肠道免疫系统已被公认为机体最大免疫器官，不仅需要肩负管理食物代谢、营养吸收和防御病原体的使命，还需要维持机体免疫平衡、协调机体免疫耐受，是机体行使免疫监视的第一道防线。小鼠机体内不同作用的肠道微生物群所启动的免疫调节机制是大相径庭的，虽然微生物调节肠道免疫系统的机制正在深入研究之中，但目前认为主要有两种方式：①与宿主细胞的直接相互作用；②通过与膳食代谢物相作用或者自己产生的免疫调节分子来调节肠道免疫系统，其可为肠黏膜细胞提供某些维持功能的必需成分，与机体形成互惠互利的特殊共存关系[7]。

2.1肠道菌群间接影响肠道免疫功能的调节 来自于消化道中的食物残渣经厌氧菌发酵后会产生多种代谢产物，包括蛋白质、多糖和激活模式识别受体的分子，如Toll样受体和NOD样受体均可刺激黏膜免疫系统[8]，并且其产生的化学信号对于肠道免疫反应的重要性已被证实。而结肠中食物经细菌发酵后所产生的主要产物是短链脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFAs)包括乙酸、丁盐酸和丙酸，其可通过肠上皮细胞进入并与宿主细胞相互作用，吸收后在血清中循环并影响宿主的免疫反应和发生疾病的风险，并可抑制具有促进维持免疫稳态的抗炎型细胞作用的组蛋白脱乙酰酶[1]。其中丁盐酸作为细菌菌株特异性分子的代表，是组蛋白去乙酰化酶的抑制剂及G蛋白偶联受体的配体，被认为是影响宿主免疫反应的关键信号分子[9]。而据最近的报道又发现丁盐酸对于肠道巨噬细胞具有免疫调节作用，故对结肠中的共生菌呈现低反应性[10]。在与普通环境下的小鼠相比无菌小鼠其结肠中具有较高水平的可发酵底物及低水平的SCFAs，由此可见SCFAs主要由微生物在肠内产生[11]。

2.2肠道菌群参与T细胞免疫功能的调节 正常稳态下肠腔内富含大量的T细胞，并对肠道内不同的抗原进行识别、清除及形成相应的耐受，一旦小鼠肠道菌群失调后不仅多数细胞因子例如IL-7、IL-10、IL-22及IFN-g会发生变化[12]，同时T细胞中的Th1、Th17、Treg也会出现明显减少[13]。但当无菌小鼠肠道内给予部分定植细菌后，细胞因子的产生又恢复到正常水平，并且Th1和Th17细胞数目也明显增加，由此可知肠道中T细胞正常功能的维持依赖于共生菌群的存在[14]。同时Ivanov团队[12]发现小肠固有层中Th17细胞分化需要特定的共生微生物群。其中与肠道中的黄杆菌、拟杆菌存在密切的相关，虽然独立于TLR、IL-21或IL-23的信号转导，但却需要适当的TGF-β活化。同时他们发现肠道菌群可调节小肠固有层中Foxp3+Treg细胞与Th17细胞的平衡，肠道微生物群的组成便成了此协调作用的关键点[7]。并且通过对无菌小鼠的研究后发现其体内CD4+CD25+T细胞的数量也明显减少[15]。故肠道菌群的减少甚至是消失对于肠道中主要调控免疫耐受功能的Treg细胞存在重要影响。但Cording团队[16]通过长期使用抗生素消耗掉肠道中菌群后发现，小鼠机体中CD4+T细胞的增殖呈全身性减少，但Foxp3+Treg的增殖仅在肠道中的MLN和PPs中受损。

进一步的研究发现肠道菌群对于小鼠T细胞的免疫功能还具有免疫佐剂功能。肠道中的共生菌有富含非甲基化核苷酸受体序列的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)，而CpG-ODN已具有与CD28相似的共同刺激T细胞活化的功能。并且CpGA类还具有诱导PDC产生INF-α，诱导NK细胞产生INF-γ，诱导单核细胞转变为成熟的树突状细胞的作用，同时CpG-ODN对T细胞的固有特性可能有助于微生物DNA和CpG-ODN对T细胞介导的免疫反应的佐剂效力[17]。同时作为肠道菌群与食物残渣相互作用后所产生的丁盐酸也可参与Treg细胞的调控能力，实验发现在丁盐酸参与的初始CD4+T分化为Treg中，作为Foxp3启动子的组蛋白3赖氨酸27乙酰化水平可增高，同时非编码保守序列1、非编码保守序列2的增强子水平也可提高，从而发现Foxp3的诱导能力和Treg的调节能力均明显提升[18]。可见无论是肠道菌群的直接作用或是间接作用，它们的存在对于小鼠肠道中及体内T细胞功能的调控都起了关键性的作用。

2.3肠道菌群参与B细胞免疫功能的调节 在肠道PPs中含有大量B细胞的生发中心，作为肠道免疫系统中的效应细胞，肠道菌群的改变对PPs的免疫功能也产生了一定的影响。研究发现在无菌小鼠体内肠黏膜免疫力不足，动物呈现较小的肠系膜淋巴结，PPs的发育不良，并且具有分泌IgA功能的浆细胞数量也明显减少，对抗病原菌的能力也明显减弱[19]，但将普通小鼠的肠道菌群移植给无菌小鼠后，此种状态即被逆转[20]。肠道菌群原核DNA的非甲基化核苷酸受体B类(CpG-B)可诱导体内共刺激分子和TNF-α产生并表达PDC，并且可上调B细胞的活化标志物和IL-6的表达量[21]。并且凋亡碎片所产生的非甲基化核苷酸受体还可以激活TLR9，特别是在它们被转化为自身抗体的免疫复合物的情况下，然后通过TLR9和B细胞受体进一步刺激B细胞，从而引起自身免疫性疾病的发生[22]。同时肠道菌群还可诱导肠道PPs中B细胞生发中心的短暂扩张，促进PPs中的B细胞发育，由于B细胞是分泌型IgA(SIgA)及部分免疫球蛋白E(IgE)的前体细胞，故B细胞的增多可进一步促进相关Ig的生成。正常小鼠出生后即具备形成SIgA 应答能力，6周时IgA分泌细胞数量才能达到成年小鼠水平，而IgA分泌延迟的关键源于小鼠从出生至断乳期，不同喂养顺序所建立的肠道菌群经刺激过程。并且Myunghoo团队[23]最近证实肠道菌群参与产生的SCFAs，不仅具有刺激宿主抗体反应性的作用，还具有加快细胞代谢，调节基因表达，促进B细胞向抗体生成细胞分化的能力，结果进一步揭示了微生物代谢物在调节宿主抗体反应中的重要性。

2.4肠道菌群参与口服耐受的调节 早在20年前口服耐受就开始受到人类的关注，而最近一些观点也反复支持即环境因素(例如抗生素，饮食，接种疫苗)改变在过敏性致敏的调节中起重要作用[24]。Andrew[25]团队发现无菌小鼠及抗生素处理过的小鼠对食物过敏原的致敏力增强，无法形成有效的口服耐受，之后通过对无菌小鼠进行菌群移植，并运用基因分析技术对无菌小鼠肠上皮进行检测分析，他们发现了梭状芽胞杆菌调节先天性淋巴细胞功能和肠上皮通透性从而保护肠道过敏源致敏的新机制，从而论证含有梭菌的微生物群在保护肠道对食物产生过敏的免疫反应中起重要作用。在口服耐受中具有重要调节作用的Treg细胞，特别是经由食物抗原产生的Treg，不仅在肠道形成并定植并且在全身循环中也被发现，其在维持系统性免疫耐受中也起重要作用[26]。Kim团队[27]发现将流质饮食喂养给无菌小鼠后，其小肠中由食物抗原诱发的Treg细胞在黏膜固有层增殖和增多，而微生物群则在结肠中诱发由外周诱导而产生的Treg(pTreg)细胞，实验发现在结肠中经微生物诱导产生的表型为RORγt 1的pTreg细胞，与经食物抗原诱导产生的pTreg细胞在表型和功能上出现了明显的差异，并且表型为RORγt 1的pTreg细胞其寿命不仅明显大于pTreg细胞，其在协调机体免疫耐受中也起重要作用。同时Rask团队[28]的研究发现，给予单一定植菌的悉生(gnotobiotic)小鼠或无菌小鼠与普通小鼠比较，后者能通过上调小肠黏膜上皮主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的表达，诱导OVA的口服耐受；而单一定植菌的悉生小鼠或无菌小鼠则不能，由此可知口服耐受的诱导和形成不仅需要肠道菌群的配合，还需要多种肠道菌群的协同作用才可完成。并且尽早建立肠道共生菌群，及保持肠道菌群的长期稳态平衡，才能促使小鼠肠道的口服耐受更加完善。

3 小鼠肠道菌群对脾脏的影响

早期的研究就发现居住环境的影响导致肠道殖民菌群的不同，最终对小鼠脾脏的结构和功能产生了影响，例如与生长在正常环境中的小鼠相比，无菌小鼠血清中IgG的分泌量明显下降，同时脾脏和淋巴结中B细胞区域和T细胞区域的结构是混乱的[29]，其中脾脏中B细胞的生发中心不仅少而且小，进而影响B细胞的分化和成熟[30]。Arya团队[31]通过实验发现无菌小鼠脾脏中巨噬细胞的标志物F4/80hi和巨噬细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞组成的多样性群体标志物F4/80lo细胞的比例和总数均减少，他们发现无菌小鼠脾脏中的多样性群体均减少，而用抗生素治疗SPF小鼠后也会导致脾脏中的骨髓细胞群减少，由此可推论肠道菌群可动态地影响外周免疫器官的先天免疫细胞比例，故可进一步认为肠道菌群在机体免疫细胞的初级发育阶段中占有重要的位置。并且肠道菌群不仅具有调节免疫系统的功能性，在维持外周循环中的中性粒细胞数量和脾脏中的CD4+T细胞功能上均起了重要的作用[32]。由此可见肠道菌群的存在不仅只对胃肠道的免疫细胞产生影响，对于机体远处免疫器官的发育、发展也有明显影响。

目前科学家外对肠道菌群与肠黏膜免疫相互作用的调控机制研究已逐步深入，通过对各个靶点及关键调控点的研究，研究人员已发现许多因肠道菌群稳态改变而引起的免疫性疾病及肿瘤发生的原因。相信随着对肠道菌群与机体之间协同作用的进一步探究，将帮助人类发现更多疾病的发病机制，并对相关疾病的治疗提供新证据及思路。

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