BRCA1与Rad51的相互作用研究进展

吴妮妮，马 丽，卢 奎,2*

(1.河南工业大学 化学化工与环境学院，郑州 450001；2.郑州工程技术学院 化工食品学院，郑州 450044)

由于环境因素以及电离辐射等多方面的影响，使得生物体细胞的正常生长机制被打乱，从而诱使生物体细胞异常生长，导致发生癌变。1994年科学家们初次分离并获得乳腺癌易感基因(BRCA基因)，发现BRCA基因中的BRCA1和BRCA2与癌症紧密相关[1]。女性若携带BRCA突变基因，则患乳腺癌、卵巢癌的概率大大增加，除此之外，其他几种器官也易发生癌变。而男性此种基因突变携带者也会患癌[2]，如患前列腺癌、乳腺癌等，但男性患癌概率远低于女性。人的Rad51蛋白是维持基因组稳定性的重要物质，研究发现在某些癌变组织中检测到细胞内Rad51蛋白的高度表达，这类细胞对于抗癌药物尤其顺铂药物的耐药性明显增强。这些研究结果从侧面证明Rad51与肿瘤紧密相关[3-8]。

BRCA1参与DNA修复，在维持基因组稳定性方面起重要作用，可与多种DNA修复酶或重组蛋白发生作用，包括Rad51、Rad50/MRE11/NIBRIN复合物、Bloom解冻酶等[9]。研究发现BRCA1和Rad51可形成不同的DNA修复复合物和作用位点，改变DNA所处环境后，BRCA1仍可发挥修复作用，且在顺铂诱导下，BRCA1的羧基末端能够与Rad51作用来对DNA损伤位点进行修复[9]。因此，目前研究重点可着手于确定用顺铂和电离辐射治疗后BRCA1在Rad51病灶中的作用。

多肽-蛋白质通过关键靶点进行的相互作用[10]在生物体内中发挥着重要作用。因此，可以利用ZDOCK和RDOCK的分子对接措施，对BRCA1和Rad51相互作用进行研讨[11]。

1 BRCA1基因

研究表明，抑癌基因的失活及原癌基因的活化与癌症密切相关[12-14]。BRCA1是一种可以抑制癌症产生的重要基因，其基因状态在乳腺癌和卵巢癌临床防治方面的应用已成为医学界的研究热点。BRCA1蛋白囊括了大量的细胞过程，包括DNA复制、细胞周期检查点控制、细胞凋亡和染色质重塑等[14]。目前对于BRCA1的研究主要集中在它的RING 区[15-16]和BRCT区[17]，其他区域研究相对较少。从BRCA1 的结构特征来看，BRCA1能够与Rad51、p53等多种蛋白结合，同时参与细胞周期的调控、DNA的修复和中心体的复制[18]，从而抑制肿瘤的产生。

一旦基因发生突变，会大幅度增加患癌风险，目前采取的降低癌症死亡率的最主要手段仍是早发现、早诊断、早治疗，这主要依赖于疾病的早期筛查。早期筛查主要对BRCA1基因的突变[19]进行检测，检测内容主要包括无义突变、剪切位点突变和移码突变。

医学上对BRCA1基因进行的基因突变性检测，主要依赖于对PCR扩增基因片段进行筛查或者直接测序的手段。PCR扩增的主要方式有：PCR-SSCP-SEQ，PCR-DHPLC-SEQ和PCR-SEQ。国内主要利用PCR-测序法[4]检测样本中BRCA1的胚系突变，寻找更多的突变位点，扩大突变谱图，以此达到对基因突变引发乳腺癌的临床病理学特征进行更深入研究的目的。当前对BRCA1/BRCA2基因突变的预测最常用的是BRCA Pro模型。

2 Rad51蛋白

HsRad51与大肠杆菌RecA同源，通过HR来进行遗传物质(DNA双链断裂)修复。要使Rad51发挥修复作用，需切除DSB末端的DNA与Rad51来形成突触纤维前体[20]。在此基础上，利用免疫组化二步法[21]，进行染色处理，得到的Rad51蛋白主要位于肿瘤细胞的细胞核内部或围绕着细胞核。研究发现Rad51蛋白含量的多少与人体能否病变形成肿瘤密切相关[3-8]。目前，临床上主要利用放射线或药物损伤来破坏肿瘤细胞的DNA，从而使得细胞死亡达到治疗肿瘤的目的。Rad51蛋白在生物体内过量表达时，会加速肿瘤细胞在体内的生长扩散甚至会加速癌细胞转移，使得肿瘤细胞或癌细胞对放疗和化疗的抵抗力增加[22]。因此，如何有效降低卵巢癌、乳腺癌细胞对癌症药物的耐药性[23-26]，需要从抑制 Rad51蛋白的过量表达这方面入手。

3 BRCA1与Rad51的相互作用

Vispé S等[11]报道，在BRCA1未发生碱基或碱基对的缺失或突变情况下，Rad51过表达的细胞在细胞周期的S/G2期对电离辐射具有抗性，这阐明了Rad51蛋白的表达量与癌症的发生紧密联系。在BRCA2碱基突变的状况下，Antoniou等[27]对Rad51上的135G-C进行患癌风险研究，结果显示，此种情况下Rad51CC纯合子的患癌率显著增加。Krupa等[28]对Rad51和XRCC3的多态性进行了研究，发现XRCC3的Thr241Met基因会增加癌症局部转移的风险，而Rad51的135G-C则可与XRCC3Thr241Met形成能够大大降低患癌风险的大型基因复合物，来产生拮抗作用。除此之外，据Söderlund小组[29]报道，使BRCA1、BRCA2 分别与Rad51形成大型复合物，这能够对乳腺癌进行预前和预后性检测。同时，BRCA1与DNA修复蛋白复合物的这种相互作用保持了基因组的稳定性，使其可以作为肿瘤抑制因子来发挥作用。

因此，现阶段可以通过对正常和癌变组织中的Rad51蛋白、BRCA1蛋白进行蛋白含量表达变化分析，研究二者与体系癌变的关系，同时也可以对BRCA1和Rad51的蛋白表达以及两者与遗传物质的相互作用进行全面分析。

4 BRCA1与Rad51相互作用的研究方法

目前，关于BRCA1与Rad51的相互作用研究方法，主要有荧光光谱法、圆二色光谱法、核磁共振法、透射电镜法和微量热涌动法等。

4.1 荧光光谱法

荧光光谱法是利用能够发荧光的物质与自身浓度之间的关系进行研究的一种方法。通过Stern-Volmer[30]方程、双倒数方程可求出结合位点数和结合常数，得到分子间的猝灭方式和机理，从而深层次研究其作用机理。Zhou Chenyi等[9]利用免疫荧光分析法，通过构建BRCA1- siRNA逆转录病毒载体来研究BRCA1羧基末端对Rad51蛋白表达含量的影响，发现BRCA1的羧基末端是顺铂治疗之后进行Rad51和BRCA1复合物构建所必须的活性位点。霍彩霞等[31]运用荧光光谱，研究ONE(奥硝哇)与HSA(人血清白蛋白)在生理条件下的结合反应，发现两者以静态猝灭的方式发生作用。姚军亮[32]则通过荧光动力学分析验证了没食子酸(GA)能够对由Heparin 引发的 R3 多肽的自聚集度起抑制作用。董超[33]用免疫荧光法、免疫共沉淀法以及免疫印迹法研究p53和BRCA1在辐射诱导条件下对DNA双联断裂损伤修复的影响，认为p53可以抑制BRCA1的重组过度修复，来维持正常的同源重组修复机制，同时，它还能够维持染色体的稳定性。吕艳阳等[34]利用荧光光谱法，模拟人体自身酸碱度条件下阿托伐他汀钙与牛血清白蛋白的荧光猝灭谱图，对其猝灭方式、相互作用力以及结合位点进行了研究，认为二者间通过疏水作用力进行结合。

目前，以荧光法为主，结合免疫印迹等分析方法来分析蛋白与多肽相互作用。这种方法相对而言较为成熟，它能够反映出蛋白与多肽之间的猝灭类型，并且能够分析得出两者之间的相互作用力类型，应用较为广泛，但由于蛋白自身会携带发色团，在进行荧光实验时，需要扣除蛋白自身的影响，构建对照组。

在进行BRCA1与Rad51复合物研究时，可用BRCA1作为猝灭剂，固定Rad51的浓度，按照一定的梯度依次增加BRCA1的浓度，测定复合物的荧光。由于BRCA1自身也有荧光效应，必须扣除空白。BRCA1与Rad51荧光强度越小，则两者的相互作用效果越好。

4.2 圆二色光谱法(CD)

圆二色光谱法(CD)是根据手性分子的偏振光变化来测定物质结构[35-36]的方法，可用来估算多肽及蛋白中各种二级结构的含量[37]。林海波[38]曾利用同步辐射的真空紫外圆二色谱仪对处于溶液环境的蛋白质进行测定，这为蛋白质二级结构含量的测定提供了新方法。张新波等[39]利用圆二色法对磺胺嘧啶(SD)和牛血清白蛋白(BSA)进行结构分析，发现加入SD会使得BSA α-螺旋含量减少，构像发生变化。丁成荣等[40]则通过圆二色法对三环唑与BSA相互作用进行分析，结果显示BSA的肽链发生收缩和重排，同时借助其他分析仪器发现三环唑还可使BSA发生构象变化。徐飞等[41]将CD应用于中药小分子(如苯丙素类、黄酮类、萜类)与蛋白质相互作用研究中，发现小分子通过与DNA 结合，对蛋白质的二级结构产生影响，使其发生结构性改变，对蛋白的结构功能产生影响。应用圆二色法来研究小分子与蛋白的相互作用，此种方法较为广泛，但是目前有关用CD法研究生物大分子与生物大分子之间的相互作用的报道并不多见，有待继续深入研究。

依据前人报道，可采用这一方法尝试对BRCA1-Rad51进行二级结构分析。测定BRCA1-Rad51及BRCA1与缓冲溶液的复合物的圆二色图谱，得到BRCA1-Rad51复合物的圆二色光谱图，利用CD Pro分析得到二级结构含量。随着BRCA1浓度的升高，Rad51蛋白结构有序性增强，则其二级结构以α-螺旋为主。

4.3 核磁共振法(NMR)

蛋白与蛋白的相互作用主要依据X-ray和NMR技术来获得蛋白质复合物的结构信息。进行蛋白质与蛋白质相互作用研究时，NMR[42]技术具有无可替代的作用，可应用其相关的顺磁弛豫方法、分子间NOE检测法以及化学位移扰动法来进行蛋白相互作用微观分析。当两者动力学行为过于复杂[42]，用其他方法难以检测时，核磁共振法几乎是获取微观作用信息的唯一手段。陈泉[43]运用NMR方法，对泛素类相关修饰蛋白质以及其与酶体系相互作用进行研究，认为泛素类修饰蛋白对酶的作用效果具有拮抗作用。张乃霞等[44]利用这种方法研究泛素-蛋白水解酶体通路，最终得到两者相互作用力较弱的结论。史喆[45]则利用NMR技术，对人体的蛋白磷酸酶进行双特异性的筛选研究，得到了在参与促使有丝分裂和细胞周期调控中占据主导地位的酶类。基于上述研究，我们可以采取NMR方法对BRCA1与Rad51的相互作用进行研究。

4.4 电镜法(TEM)

透射电子显微镜(TEM)[46]在一定条件下能够观察到物质的亚显微结构或者超微结构，有利于进行微观结构动态分析，因此电镜法较为常用。通常将电镜法与其他分析法相结合，来进行结构分析。陈佳弘等[47]通过扫描电镜观察到丝素蛋白在CaCl2-H2O-C2H5OH体系中的微观结构变化，认为丝素膨大，并且断裂为片状、层状结构，晶体结构被破坏。吴丽萍等[48]利用透射电镜与红外光谱结合的方法，研究了pH对丝胶蛋白微观结构以及宏观构型变化的影响，发现pH越小，丝胶蛋白排列越紧密且体系越混乱。Hjalmarsson等[49]对鼠的肾小球内皮细胞进行电镜分析，发现小鼠内皮细胞糖萼被内皮窗孔充满。利用电镜作相互作用研究时，可在适宜温度下，将ssDNA、HsRad51加到预先配置好的缓冲溶液中，放置一段时间，再向其中加入BRCA1肽，经过一系列后续处理，对所形成的复合物BRCA1-HsRad51-ssDNA进行染色处理，进行电镜观察，得到微观构型。

4.5 微量热涌动法(MST)

Ludwig[50]首次阐明分子能够在给定的温度梯度条件下发生定向运动，并把这种分子在温度梯度下的定向运动现象称为热泳动现象。Wienken 等[51]运用微量热涌动方法，对溶液中生物大分子蛋白质与一些小分子的相互作用进行了深入研究。在进行BRCA1-Rad51相互作用时，可将不同浓度的未标记的BRCA1肽与固定浓度的荧光标记蛋白Rad51蛋白混合，静置，再进行MST分析。在此过程中，Rad51作为受体，BRCA1作为配体，最终得到Kds值。与其他方法相比，MST法在蛋白与多肽的相互作用研究中应用较少，但它具有特殊的优势。

4.6 其他方法

在进行生物大分子与生物大分子或生物大分子与有机小分子之间的相互作用研究时，除了上述几种方法外，还可以结合BiFC[52-53]、GST Pull-down[54]等方法，使得作用机理更为清晰明了，也就更能阐明其基本作用规律以及结合力等详细信息。

5 结语

乳腺癌的形成涉及多方面的因素，而基因发生功能性改变是乳腺癌发生的关键因素。BRCA1基因在一定条件下发生突变，会大大增加患癌风险。Rad51蛋白是生物体内进行同源重组修复过程的关键蛋白。通过对BRCA1与Rad51相互作用的研究，探索其相互作用机理、关键作用位点以及修复机理等，可为乳腺癌治疗药物的设计提供基础。

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