响应面法优化青钱柳速溶茶的酶解工艺条件

, ,,,,,*,,,

(1.右江民族医学院基础医学院,广西百色 533000; 2.广西高校右江流域地道中药材(民族医药)研究重点实验室,广西百色 533000； 3.右江民族医学院药学院,广西百色 533000)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja)又名青钱李、山麻柳、一串钱、甜茶树、摇钱树等,为胡桃科植物,是国家重点保护的濒危植物之一[1],属三类保护植物。其主要成分为三萜皂苷、黄酮、甾体、有机酸等,具有降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤、抗氧化、防衰老等药理活性[2],在防治糖尿病方面的功效尤为突出,其降糖的主要活性成分为黄酮类和多糖类[3]。

民间将青钱柳用于治疗或制成茶饮料时常用热水煮的方式,用时较长且不方便,而速溶茶可以解决这个问题。速溶茶是在保证有效成分的基础上,将其通过轧碎处理、浸提、净化(过滤)、转溶、浓缩、干燥等工艺过程,加工成一种易溶入水而无茶渣的颗粒状、粉状或小片状的新型饮料。速溶茶不仅可以节省人类准备茶的时间和精力,还能保存原有味道[4]。本研究组曾用微波-超声波联用和乙醇来提取青钱柳总黄酮[5],其得率较高,但用的是乙醇,虽然用醇提取出来的有效成分较多,但醇为有机溶剂,会使有效成分的结构发生改变或者丢失,从而使该中药制剂的某种疗效发生改变。水煮的中草药,其有效成分出来的很少,而生物酶的使用能够提高有效成分的溶出。因此,为了饮用方便和提高治疗效果,并结合生物酶的优点,本研究以青钱柳降糖活性成分黄酮和多糖含量及浸膏得率为指标,采用综合评分法,通过响应面实验优化青钱柳速溶茶的酶解工艺,旨在为下一步开发青钱柳提供理论依据和科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青钱柳枝叶 2015年7月采于广西隆林,并经右江民族医学院生物教研室黄元河老师鉴定,干燥粉碎后备用;芦丁标准品 由中国药品生物制品检定所提供,批号为100080-200707;葡萄糖标准品 J&K CHEMICAL LTD;三氯化铝、甲醇、乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、浓硫酸 均为分析纯;纤维素酶(50 U/mg)、果胶酶(1000 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg) 均为上海源叶生物科技有限公司生产。

DF-15型台式连续投料粉碎机 温岭市林大机械有限公司;FA1104型电子天平 上海舜宇恒平科技仪器有限公司;TU-1800型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HHS21-4电热式恒温水浴锅仪器 江苏金坛宏凯仪器厂;金坛80-2电动离心机 江苏省金坛市医疗仪器厂;KQ5200E超声波仪器 昆山市超声仪器有限公司;1010-2型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂邮箱公司。

1.2 实验方法

1.2.1 青钱柳叶速溶茶生产工艺 青钱柳叶→粉碎过筛→酶解→抽滤→灭酶→滤渣再次酶解→离心过滤→灭酶→合并滤液,真空浓缩→喷雾干燥→青钱柳速溶茶。

青钱柳叶粉碎过40目筛。称取青钱柳粉末1.0 g,按照液料比加入一定浓度的酶溶液,于超声波(200 W)中以一定温度超声酶解一定时间,过滤,滤液于90 ℃水浴1 h灭酶,重复两次,合并两次滤液,真空浓缩(0.1 MPa、55 ℃)和喷雾干燥(热风温度180 ℃,热风流量28.60 m3/h,入料流量1060 mL/h)后得到青钱柳速溶茶。

1.2.2 黄酮含量测定 以芦丁为标准品,配制不同浓度梯度,采用三氯化铝显色法[5],运用分光光度计于409 nm处测吸光度,以吸光度A1与浓度C1进行直线回归,得回归方程为A1=22.737C1+0.0032,r=0.9998。将合并后的滤液用蒸馏水定容至25 mL,取一定量溶液按照芦丁标准品的方法测定并计算黄酮含量。其计算公式为:黄酮含量(mg/g)=黄酮质量(mg)/干品质量(g)。

1.2.3 多糖含量测定 以葡萄糖为标准品,配制不同浓度梯度,采用苯酚-硫酸法测定[6],运用分光光度计于490 nm处测吸光度,以吸光度A2与浓度C2进行直线回归,得回归方程为A2=20.82C2-0.0836,r=0.9999。浓度在0.01～0.05 (mg/mL)之间呈现良好的线性关系。取定容后的溶液10 mL,加4倍量的95%乙醇,置低温(4 ℃)静置过夜冷冻后,在3000 r/min下离心15 min,收集沉淀,沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤两次,真空干燥至恒重,得粗多糖。粗多糖用水定容至50 mL,取一定量溶液按照葡萄糖标准品的方法进行青钱柳多糖含量的计算。其计算公式为:多糖含量(mg/g)=多糖质量(mg)/干品质量(g)。

1.2.4 浸膏得率的测定 量取定容后的溶液10 mL,水浴蒸干后置烘箱105 ℃干燥3 h,取出，干燥器内冷却30 min,迅速称定质量。其计算公式为:浸膏得率(%)=浸膏质量(mg)/干品质量(g)×100。

1.2.5 酶解工艺优化 以青钱柳活性成分和浸膏得率为指标,进行综合评分[7-8],考虑到青钱柳的活性成分主要为黄酮和多糖,其二者权重系数均为0.45,而浸膏得率的权重系数则为0.1,评分时以各指标在响应面实验时的最大值为参照将数据进行归一化,各项的值分别乘以不同权重系数再相加即为综合评分Y=0.45X1×100/15.01+0.45X2×100/11.73+0.1X3×100/12.74。根据单因素实验结果:0.75%纤维素酶、酶解时间30 min、酶解温度50 ℃、液料比20∶1 (mL/g),酶解2次,以酶浓度(A)、浸提温度(B)、提取时间(C)、液料比(D)为因素作为响应面分析因素水平见表1,以综合评分值(Y)为响应变量,进行响应面实验[9-10]。

表1 响应面分析因素水平Table 1 The factor levels of response surface analysis

1.3 数据处理

采用Design-Expert 10软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 响应面实验设计及结果

在单因素实验结果的基础上,确定因素为酶浓度(A)、浸提温度(B)、提取时间(C)、液料比(D)设计响应面实验,以黄酮含量、多糖含量、浸膏得率计算综合评分。根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理,以综合评分Y为考察指标,采用Design-Expert软件设计四因素三水平29个实验点的响应面分析,设计方案及综合得分的响应值见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Test design and result of Box-Behnken experiment

2.2 模型拟合及显著性检验

通过 Design-Expert10.0软件对响应值与各因素编码值进行回归拟合,得到回归方程如下:Y=96.82+2.84A-3.78B-3.55C+7.61D-2.11AB-1.94AC+1.75AD+1.71BC-5.88BD+5.10CD-3.51A2-13.86B2-13.99C2-13.57D2。并对该响应面的二次回归方程进行方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

注：* 差异显著(p<0.05);**差异极显著(p<0.01)。

2.3 因素交互作用

交互项的响应面分析见图1。从图1a、b、c可以看出,综合评分都随着酶浓度的增加而增大。图1a中,随着酶解温度的变化(45～55 ℃),青钱柳速溶茶的综合评分先增大后减小,约在49.4 ℃达到最大值。图1b中,随着酶解时间的变化(20～40 min),青钱柳速溶茶的综合评分先增大后减小,约在28.9 min达到最大值。等高线表明酶解时间和酶浓度二者交互作用对青钱柳的综合得分影响不显著(p>0.05)。图1c中,随着液料比的变化(15∶1～25∶1 mL/g),青钱柳速溶茶的综合评分先增大后减小,约在21.2∶1 (mL/g)达到最大值。等高线表明液料比和酶浓度二者交互作用对青钱柳的综合得分影响不显著(p>0.05)。从图1d可以看出,随着酶解温度的变化(45～55 ℃),青钱柳速溶茶的综合评分先增大后减小,约在47.8 ℃达到最大值。随着酶解时间的变化(20～40 min),青钱柳速溶茶的综合评分先增大后减小,约在28 min达到最大值。等高线表明酶解温度和酶解时间二者交互作用对青钱柳的综合得分影响不显著(p>0.05)。从图1e可以看出,随着酶解温度和液料比的变化,青钱柳速溶茶的综合评分先增大后减小,约在46.8 ℃、22.1∶1 (mL/g)达到最大值。等高线表明酶解温度和酶解时间二者交互作用对青钱柳速溶茶的综合得分影响极显著(p<0.01)。从图1f可以看出,随着酶解时间和液料比的变化,青钱柳的综合评分先增大后减小,约在25.6 min、20.9∶1 (mL/g)达到最大值。等高线表明酶解温度和酶解时间二者交互作用对青钱柳的综合得分影响极显著(p<0.01)。

图1 各因素及其交互作用对综合评分影响的响应面曲面图Fig.1 Response surface plot of synthesis grade analysis effect of factors and their interactions

2.4 验证实验

应用Design-Expert10软件对回归方程进行分

析,得到的最优响应结果为:酶浓度0.841%、酶解温度48.672 ℃、酶解时间28.794 min、液料比21.773∶1 (mL/g),综合评分为99.749±0.711。根据实际情况优化为:酶浓度0.84%、酶解温度49 ℃、酶解时间29 min、液料比22∶1 (mL/g)条件下进行3次平行实验,测得黄酮和多糖含量的平均值分别为15.14、11.88 mg/g,浸膏得率为23.03%,综合评分为99.99,与预测值相差0.241,说明该优化条件结果较为可靠,具有一定的实用价值。所得浸膏呈棕黄色,在此条件下进行喷雾干燥生产出来的产品颗粒细腻,无结块,色泽呈鹅黄色,气香味浓,口感适中,溶液均匀无沉淀。

3 结论

青钱柳速溶茶的酶解最佳工艺条件为:纤维素酶浓度为0.84%、酶解温度49 ℃、酶解时间29 min、液料比为22∶1 (mL/g),所得黄酮和多糖含量分别为15.14、11.88 mg/g,浸膏得率为23.03%,综合评分为99.99,与模型的预测值99.75接近。

[1]何艳,殷志琦,张健,等. 青钱柳地上部分的化学成分研究[J]. 药学与临床研究,2012(3):187-189.

[2]崔保松,李帅. 青钱柳叶的化学成分研究[J]. 中草药,2012,43(11):2132-2136.

[3]沈兵,赵巍,欧文斌,等.青钱柳中α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究[J]. 浙江大学学报:农业与生命科学版,2014(3):275-280.

[4]Pandey R K,Manimehalai N. Production of Instant Tea Powder by Spray Drying[J]. International Journal of Agriculture and Food Science Technology,2014,5(3):197-202.

[5]黄元河,潘乔丹,唐海燕,等. 微波-超声波联合提取青钱柳总黄酮和总三萜提取工艺[J]. 湖北农业科学,2014,53(22):5515-5518.

[6]潘乔丹,唐海燕,黄元河,等. 全缘栝楼多糖及提取物不同极性部位抗氧化研究[J]. 食品研究与开发,2015(10):1-4.

[7]章军,刘宇政,王跃生,等. 综合评分法优化葛根芩连汤提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志,2012(2):1-3.

[8]张跃,焦连庆,于敏,等. 多指标综合加权评分法优选蜂胶总黄酮提取工艺研究[J]. 中国药师,2012(6):759-762.

[9]易东阳,李勇华. 响应面分析法优化慢性湿疹搽剂提取工艺[J]. 中成药,2014(7):1545-1548.

[10]Fan T,Hu J,Fu L,et al. Optimization of enzymolysis-ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Momordica charabtia L. by response surface methodology[J]. Carbohydrate polymers,2015(115):701-706.