金黄色葡萄球菌小菌落突变株所致相关感染的研究进展

宋 娟

小菌落突变株（small colony variants，SCV）是一种具有独特表型 （生长率低、菌落形态不规则以及生化特性异常）及致病特征，且生长缓慢的细菌亚群。自1910年Jacobsen首次在伤寒埃伯泽菌株中发现SCV现象以来，人们陆续发现许多细菌如表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、羊布鲁杆菌、大肠埃希菌及淋病奈瑟菌等都具有形成这种SCV的能力。1957年，Jensen[1]首次报道了金黄色葡萄球菌SCV（金葡菌，SASCV）。20世纪90年代中期，人们在研究中发现临床许多慢性和复发性感染与SASCV的独特表型关系密切[2]，此后国外学者们对SASCV的研究越来越广泛深入，但国内的研究极少。本文对SASCV的形成机制、临床相关感染、诊断和治疗进行阐述。

1 SASCV形成机制

目前研究认为，SASCV临床分离株多数是由于呼吸作用时合成能量不足所致，主要表现为与呼吸链相关的两种特异营养缺陷类型，即电子传递链缺陷型和胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型。前者又分为甲萘醌营养缺陷型和血红素营养缺陷型，主要表现为甲萘醌或血红素缺陷。该类SASCV的产生与氨基糖苷类抗菌药物的使用密切相关。不论体内外，在氨基糖苷类药物存在的情况下，金葡菌形成SCV的概率均显著提高。胸腺嘧啶脱氧核苷（TD）合成缺陷型SASCV（TDSASCV）是金葡菌对外源胸腺嘧啶脱氧核苷吸收受阻所致，主要见于长期应用甲氧苄啶-磺胺甲唑（SXT）等磺胺类药物的病例，该类药能够阻止四氢叶酸的合成，而后者是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的一个辅基。此外，还存在其他类型如CO2营养缺陷型和营养缺陷不明的SASCV分离株。而SASCV临床分离株有时可表现为多种营养缺陷共存。

因SASCV与其亲本株可同时出现，而SASCV可以快速回复成野生株表型，且这种转化在体内外均可进行，故近年来人们又提出SCV的发生与金葡菌发生基因突变有关。目前，已经报道多种基因（ctaA、menB、menD、hemA、hemB、hemH、mutS、fusA、thyA）的突变均能导致金葡菌出现SASCV表型[3]。

2 SASCV相关临床感染性疾病

早期研究发现，一些非特异性吞噬细胞如内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、造骨细胞、角质化细胞可有效吞噬金葡菌。被吞噬的为正常金葡菌时，内吞作用可迅速破坏裂解细菌胞体。近年研究发现[4]，SASCV比相应的野生株更能持续存活于细胞中，同时细胞对SCV的内吞作用可使SCV免受宿主防御系统和抗菌药物的攻击。而当宿主细胞形成应激的保护性环境时，SCV就会引起隐性或复发性感染。迄今为止，SASCV对慢性感染疾病的重要意义已达成共识，临床上已报道与SASCV有关的感染多种多样，主要见于以下几大类疾病。

2.1 髋假体关节感染

髋假体关节感染（PJI）是全髋关节置换术后一个严重并发症。金葡菌是最重要的感染病原菌之一，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）为PJI治疗失败的因素之一。有研究发现，持续和复发性的假体关节感染多与SASCV密切相关。Sendi等[5]在一项为期4年的研究中发现， 83例PJI患者中有5例（6%）在关节抽吸物和术中组织标本中培养出SASCV。这些患者在检出SCV之前存在血流感染史、长期抗生素应用史、髋关节翻修术等情况。此外，值得注意的是，1例患者外周组织的透射电镜图像显示在成纤维细胞内可见细菌。由于该例患者的SASCV是从滑膜组织标本中培养出来的，故研究者推测这些细胞内的细菌很有可能是SASCV，支持了上述假说，即SCV在细胞内隐藏，逃离宿主防御系统和抗生素的攻击，从而导致复发性感染。Tande等[6]研究了113例葡萄球菌感染的PJI病例，发现38例与SCV有关，其中SASCV10例（26.3%），其他为表皮葡萄球菌SCV23例，头状葡萄球菌SCV2例和路邓葡萄球菌SCV3例。与没有SCV检出的PJI患者相比，SCV患者有较长的假体关节植入史，与上一次手术间隔时间较长，且PJI的临床症状持续存在。大部分患者以前因PJI做过手术，而更多的SCV患者在过去6个月内至少接受了120 d 的抗生素治疗。该研究还指出，金葡菌PJI患者出现治疗失败的可能性会是非金葡菌感染患者的4倍，但PJI治疗失败是否为SCV感染所致没有发现不同。Sendi等[5]则指出，不管是SCV还是正常金葡菌所致的持续PJI，在基于MIC值选择抗菌药物治疗的同时，建议尽快（6～8周以内）移除外来装置。

2.2 慢性骨感染

慢性骨感染具有经久不愈的骨内死腔、深达骨质感染、时发时愈的慢性窦道及大量炎性瘢痕形成的特点，治疗不易彻底、反复迁延不愈、根治困难。1995年，Proctor等[2]自5例慢性骨和/或关节感染患者的组织标本中培养出了SASCV，且营

养缺陷类型各不相同，涉及甲萘醌、血红素和CO2营养缺陷型。临床数据显示，这些患者对抗生素治疗方案反应不佳，故认为葡萄球菌慢性骨感染与SCV的形成密切相关。就骨感染而言，局部庆大霉素治疗经常被使用，而von Eiff 等[7]在慢性骨髓炎患者局部庆大霉素治疗暴露的位置发现了甲萘醌或血红素营养缺陷型SASCV的生长，随后又通过体外庆大霉素的诱导试验诱导出了SCV，从而提出甲萘醌或血红素营养缺陷型 SASCV的出现可能与氨基糖苷类抗菌药物的使用有关。他们还发现，尽管SASCV体外庆大霉素的药敏试验判读为敏感，但其MIC值却高于亲代菌株32倍以上，提示SASCV对氨基糖苷类的敏感性在降低，Baltch等[8]和 Maduka-Ezeh等[9]研究也证实了这一点。对慢性骨髓炎患者SASCV存在位置的研究，Kalinka等[10]指出金葡菌可以通过表达黏附素黏附在骨基质上，或进入成骨细胞内，在感染的急性期借助骨组织的庇护逃避机体免疫系统和外来抗菌药物的攻击，之后再逐渐形成SCV启动新的感染。Lew等[11]认为SASCV存在于死骨碎片内，指出慢性骨髓炎患者因血供不足极易形成死骨碎片，金葡菌躲藏在死骨碎片里，抗菌药物或机体免疫系统很难作用到死骨碎片中的细菌，这种情况迫切需要外科手术来清除感染。而Archer等[12]和Mitchell等[13]在研究中指出，死骨碎片可能是金葡菌生物膜形成的最佳基础。形成生物膜的细菌表现出更强的耐药性，其感染易慢性化并难以控制，进而促进了SCV的发展。

2.3 囊性纤维化呼吸道感染

囊性纤维化（CF）是一种外分泌腺功能紊乱的遗传性疾病， 好发于欧美白色人种，可累及呼吸、消化、内分泌、生殖等多个系统。其中反复急进性的肺部感染为其主要的致死原因。CF患者的呼吸道提供了一个独特的生态环境：嗜中性粒细胞的吞噬、缺氧、与同时感染的微生物竞争，以及抗生素选择压力，这就导致了各种形式的细菌适应，包括SCV的出现[14]。Sparham等[15]最早在CF患者痰标本中检出TD-SASCV，并提出TDSASCV感染可能与SXT的治疗有关。随后Gilligan等[16]在对200例CF患者进行的研究中发现有20例（10%）培养出了TD-SASCV，这些患者均有长期的SXT治疗史（至少30.9个月），且所有TDSASCV菌株的体外药敏试验显示对SXT都耐药。Kahl等[17]在对28例金葡菌呼吸道感染的CF患者进行分析时发现，有19例患者长达31个月都分离出SCV，提示SCV比同源的正常金葡菌更能持续地存在于真核细胞内。研究亦发现大多数的SCV都是胸苷依赖型或血红素-胸苷依赖型，SXT的使用与TD-SASCV的出现之间存在关联关系。而Besier等[18]、Schneider等[19]和Wolter等[20]在研究中除发现CF呼吸道感染患者SASCV流行率高，大多数SCV为胸苷依赖型，且与SXT长期使用相关外，均指出相比正常金葡菌感染，SCV感染的患者年龄较大，且多与铜绿假单胞菌合并感染，患者的肺功能也会有更大的下降。Green等[21]还对SCV出现与CF患者阿奇霉素长期使用的关联性进行了为期6个月的研究。开始时260例CF患者中4.1%发现了SASCV，6个月后金葡菌对大环内酯类抗菌药物的耐药率显著增加。但并没有新的SCV出现，结果似乎提示二者并无关联。然而，以往的研究中SXT诱导和选择出TD-SASCV多在使用SXT 1年之后，6个月的阿奇霉素治疗似乎对于SCV的出现来说太短了，可能需要进一步延长观察时间。迄今为止，还没有任何关于大环内酯类药物治疗与SCV出现的关联报道。

2.4 其他感染

2.4.1 心脏相关植入物的感染 与心脏相关的外来异物主要指植入电子装置[（如永久性心脏起搏器、左心心室辅助装置（LVAD）]和各种人工瓣膜，随着这些植入物的使用增加，引发的感染亦呈上升趋势。尽管葡萄球菌是导致这些感染最常见的的病原体，但目前关于SASCV引发相关感染报道并不多，主要见于起搏器相关感染[22]和LVAD

相关感染[23]，而近期关于金葡菌引发人工瓣膜感染性心内膜炎的多中心报道并没有提到SCV的流行[24]。因金葡菌容易黏附在医疗植入物或组织表面形成生物膜而致生物膜相关性疾病，故无论是何种金葡菌感染，尽快手术移除感染的外来装置才是控制感染的关键所在。

2.4.2 皮肤、黏膜和软组织感染 关于葡萄球菌SCV可能是皮肤或黏膜感染病原菌的研究近年来亦有报道。von Eiff等[25]在28个月的时间内反复从1例毛囊角化病（一种基因性皮肤病）患者的皮肤标本中检出SASCV，且发现，分离出的SASCV能被体外培养的HaCaT细胞（一种角质形成细胞）吞噬且持续存在，抗菌药物很难清除。另一例疝修补术患者，术后13个月出现了皮下脓肿破溃，窦道形成等慢性肉芽肿性炎症表现，病原学培养出一种甲萘醌-血红素营养缺陷型SASCV[26]。1例AIDS患者因车祸导致偏瘫后反复发作髋部脓肿，病原学检出了MRSA-SCV，在采取肌内注射治疗髋部脓肿2个月后，仍从血培养、脓肿液培养中检出SCV。最后患者死亡，尸检标本也检出SCV，最终确定为TD-SASCV菌株[27]。von Eiff等[28]对125例AIDS患者进行了鼻腔黏膜金葡菌携带情况的调查，发现32%患者（40例）鼻腔携带金葡菌。尽管40例中只有3例（2.4%）是SASCV，但研究指出AIDS患者鼻腔内SCV的定植极有可能是严重感染的来源，这有待进一步研究。

3 SASCV感染的诊断

对于普通临床实验室而言，SCV不寻常的生理、代谢和形态特征的鉴别具有难度，不但难以识别，而且更难复原和存储。但是，发现和报告SCV对于临床医师来说非常重要。因为它们是一种慢性感染的指示，作为特定治疗依据。对SASCV感染诊断可从以下几方面入手。

3.1 选择高质量标本

对于CF患者来说，可使用合格痰标本进行培养；对于其他相关感染，建议送检关节抽出物、术中组织样本、活检标本或液体标本等，应杜绝拭子标本。如果假体装置或骨骼被移除，对其进行超声震荡处理则能提高SCV的检出率[29]。

3.2 培养和鉴定

仔细处理标本和选择合适的琼脂平皿进行培养是SCV诊断的先决条件。葡萄球菌SCV在哥伦比亚血平皿上空气和二氧化碳环境中均能生长，使用葡萄球菌选择性培养基或显色培养基反而不生长或生长不良，故首选哥伦比亚血平皿。SCV通常在24 h以后，大约48～72 h才能在固体培养基上肉眼可见。其菌落细小，约为亲代正常菌株的1/10，多呈针尖样（TD-SCV可表现出一种不同寻常的“荷包蛋”样菌落），无色素或色素生成明显减少，缺失或β-溶血能力下降，容易被误认为是生长缓慢的棒状杆菌或非溶血性的链球菌。此外，它们经常与亲代菌株混合生长，表型并不稳定，极易恢复正常表型。由于SCV生长缓慢，代谢变化大，经典生化反应缺失或减少，过氧化氢酶、凝固因子、凝血酶反应或其他用于识别的反应也被延迟或缺如，因此，所有基于生化过程的鉴定方法在SCV中都不可靠，目前主要依靠PCR和基因测序技术。已被证实为金葡菌识别的分子指标如nuc、clfA、eap、coa、sodM等也能很好地识别SASCV[30]。对于正常的葡萄球菌表型，16S rRNA特别是rpoB基因序列，对于最终确定种和亚种非常有用。然而，鉴定葡萄球菌SCV，必须考虑已知公共序列数据库的局限性[31]。

3.3 药敏试验

由于SCV的低生长率和低代谢率，各种常规方法检测其对抗生素的敏感性存在困难或不能完成。因此，尽管传统的方法（琼脂扩散法或E 试验）可以提供SCV对抗生素敏感与否的证据，但应保证细菌必须在琼脂平皿上生长足够的时间（3～5 d），更要谨慎地评估其MIC数据。因SCV是在细胞内环境中被诱导和选择的，故一些体外细胞培养模型被用来进一步研究SCV在细胞内的抗药性[32]。综合起来，这些模型结果显示，所有抗菌药物在细胞内对正常菌株的活性都比对SCV菌株高，提示在宿主细胞内，SCV对药物治疗具有更高的耐受性，临床在治疗SCV感染时要充分考虑到这些因素。

4 SASCV感染的治疗

目前对葡萄球菌SCV感染的最佳治疗方法尚不清楚，但临床在选择治疗方案时应综合考虑以下问题：①SCV营养缺陷的类型；②SCV在宿主细胞内的位置；③SCV和∕或亲代菌株药敏试验的结果。此外，还必须考虑各感染部位的药动学 /药效学（PK/PD）数据等[33]。而理想的抗SCV药物，不但要具有能够穿透细胞膜进入SCV所在宿主细胞内的能力，还能在胞内保持杀灭这种缓慢生长表型细菌的抗菌活性。利福平是能够满足这些要求的抗葡萄球菌药物，但利福平单药使用将很快出现高水平耐药，故建议联合其他一种或多种敏感的抗生素共同治疗SCV。Baltch等[8]的报道指出，将达托霉素、利福平及庆大霉素三者合用或达托霉素-利福平或庆大霉素-利福平二者配伍使用对清除人单核细胞源性巨噬细胞内的SASCV效果最为明显。Sendi等[5]则将左氧氟沙星与利福平联合使用，成功治愈了5例由SASCV引起的髋关节假体感染患者。而对于MRSA-SCV感染，糖肽类药物万古霉素原则上应是首选，但Garcia 等[34]指出万古霉素不能杀死SCV ，Lenhard等[35]的实验研究也表明万古霉素有利于SCV亚群的形成。因此，在已证实或可能发生MRSA-SCV的持续感染时，建议使用具有抗MRSA活性的其他替代药物。

总之，SASCV所致的慢性感染极为棘手，给微生物室和临床均带来了严峻的挑战。实验室人员要加强学习，不断提高对SCV菌株的分离、鉴定及药敏能力；临床医师不但要对已发生的SASCV感染采取积极的治疗（如尽快移除感染的植入装置、选择敏感抗菌药物持续治疗等），还要对潜在的感染进行有效的预防，从而减少SASCV感染的发生。