NF-κB在动脉粥样硬化疾病中的研究进展①

欧思琳 李茹冰

(广州军区广州总医院药剂科，广州 510010)

动脉粥样硬化是动脉或血管中发生的主要严重疾病，动脉狭窄和硬化是缓慢发生的过程，且会引发肾衰竭等并发症，其是由动脉中胆固醇和细胞碎片组成的脂肪损伤引起。73%的心肌梗死是由于不稳定的斑块破裂所造成的。转录因子核因子-κB(NF-κB)已被证实能诱导多种细胞因子、黏附因子、趋化因子、急性期反应蛋白和参与炎症反应的酶的基因表达[1]。Yu[2]报道NF-κB是导致动脉粥样硬化形成的一个重要影响因子，它涉及动脉粥样硬化形成过程中的多种病理过程，包括泡沫细胞形成、血管炎症、血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、动脉钙化和斑块进展。Sjöberg等[3]报道了抑制NF-κB的信号传导可以防止动脉粥样硬化。Li等[4]报道了CyPA-p-ERK1/2-NF-κB信号通路贯穿了动脉粥样硬化的整个过程，加速了动脉粥样硬化的发展进程。

本文论述了NF-κB的构成和动脉粥样硬化的特点，旨在总结NF-κB对动脉粥样硬化各个阶段影响的最新进展，为开发新的基于NF-κB的干预治疗动脉粥样硬化疾病提供靶点。

1 动脉粥样硬化

近几十年来，动脉粥样硬化及其并发症的发病率大幅度上升，是普通人群高死亡率的间接原因。动脉粥样硬化是由血脂异常引起的慢性炎症疾病，由先天和适应性免疫应答介导，炎症是动脉粥样硬化进展所有阶段的关键因素。炎症在动脉粥样硬化中脂质条纹形成和斑块破裂后形成血栓两个过程中起到重要的作用[5]。血液中低密度脂蛋白通过内皮细胞内化并进入动脉壁内膜时，疾病就开始了。脂质条纹是动脉损伤的标志，脂质条纹成熟加速了斑块的损伤。在动脉粥样硬化后期，促炎细胞因子加速动脉粥样硬化斑块的不稳定，各种细胞凋亡和基质的降解，从而加速斑块破裂和血栓形成。内皮细胞损伤后，内皮细胞失去了选择性渗透屏障的功能，导致脂蛋白受体表达改变，低密度脂蛋白被修饰和氧化成氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)；oxLDL等复合物可通过TLR4/NF-κB通路途径促进巨噬细胞和单核细胞增生形成泡沫样细胞，脂质沉淀形成粥样斑块，粥样斑块脱落形成血栓，引起血管狭窄。Calvayrac等[6]研究表明oxLDL显著激活了人血管平滑肌细胞中的NF-κB信号传导，降低I-κB水平，增加了NF-κB与DNA结合。研究表明抵抗oxLDL诱导的NF-κB激活，可以阻断巨噬细胞对oxLDL的摄取，从而抑制了泡沫细胞的形成[7]。同时，NF-κB增强了LPS诱导的巨噬细胞胆固醇的积聚。

2 NF-κB

炎症最重要的调节因子是核因子-κB(NF-κB)[8]。在许多疾病如自身炎症性疾病、恶性肿瘤和急性呼吸窘迫综合征等中可以发现NF-κB异常激活[9]。NF-κB可以调节炎症因子的表达。NF-κB家族包括了RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105-p50)和NF-κB2(p100-p52)五个成员。五个成员的N-末端均包含Rel同源结构域(RHD)，其介导NF-κB与DNA的特异性结合、二聚化及与其抑制蛋白结合等。p65、RelB和c-Rel的C末端含有转录激活所必需的反式激活域(TAD)[10]。前体p105和p100的C末端锚蛋白复合体被泛素化后，导致部分蛋白水解后分别释放p50和p52，该类蛋白因缺乏TAD而无独立激活基因转录的功能。这五种蛋白之间可相互形成同源(如p50/p50)或异源(如 p50/p65)二聚体。不同二聚体与DNA结合对炎症调节起到的作用不同，如p50/p50、p65/p65和p52/p52同源二聚体与DNA结合后抑制了NF-κB相关炎症基因的表达；RelB/p50、RelB/p50和p50/p65异源二聚体则促进了促炎因子的表达等[11]。而p50/p65异源二聚体是NF-κB所有形式中含量最高，也是最重要的一种，几乎存在于所有细胞中，是因为P50/P65异源二聚体的氨基端和二聚化结构域形成的环状结构域可以非特异性地识别DNA核糖磷酸骨架[1],进而P50/P65异源二聚体与DNA结合亲和力比其他二聚体强。而p50/p50同源二聚体，因为p50无激活结构域基团，其与DNA结合后不能激活基因的转录，因此在NF-κB的基因调控中起到抑制作用[12]。静息状态下，NF-κB与κB抑制剂(I-κB)结合，以非活性形式被阻滞在胞浆中。在某些应激反应中，如TNF-α和IL-1可通过特定信号通路激活I-κB激酶(IKK)复合物，磷酸化I-kB家族成员，使其泛素化并被蛋白酶体降解，降解后释放的NF-κB可转移到核内，进而调节其下游的基因表达[13,14]。

NF-κB的活化可通过经典和非经典的刺激途径而激活[15]。NF-κB激活的经典途径主要是致炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和可与Toll作用的病毒产物等，与相应受体结合后刺激NF-κB二聚体与I-κB分离从而进入细胞核进行基因转录。而非经典途径主要涉及p100的修饰而释放p52和RelB/p52的核转入。经典途径通过刺激促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子、诱导型酶和促血管生成因子的表达在宿主先天免疫反应中起重要作用[16]。Madonna[17]报道非经典途径与适应性免疫应答密切相关，如继发淋巴器官发生和淋巴细胞成熟。Miskolci等[14]发现冠心病患者血液中嗜中性粒细胞的NF-κB的持续激活受I-κBα持续磷酸化和降解的调控。此外，在不稳定型心绞痛患者血清中NF-κB的活性明显高于稳定型心绞痛患者，证明NF-κB参与了斑块的不稳定过程[18]。炎症反应涉及细胞黏附和迁移的协调调节；由细胞因子和趋化因子介导募集炎性细胞从而引起组织损伤[19]。

3 NF-κB与动脉粥样硬化

3.1NF-κB与血管内皮细胞 根据损伤反应假说：动脉粥样硬化病变起始原因于内皮损伤。血管内皮细胞在致动脉粥样硬化中起了三个重要作用。第一起到了维持血管内空间和组织空间之间的选择性渗透屏障功能；第二为白细胞提供非黏附表面；第三修饰脂蛋白和将脂蛋白转运到血管壁。早期动脉粥样硬化关键特征是炎症刺激黏附分子的上调，血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和内皮细胞白细胞黏附分子-1(ELAM-1)等这些黏附分子既能使单核白细胞黏附于细胞内皮，又能使其向内膜迁移，使其损伤程度增加。血管内皮损伤后脂质被运送到内膜下，巨噬细胞和血管平滑肌细胞通过细胞膜表面的清道夫受体摄取大量脂质转化为泡沫细胞，泡沫细胞崩解[20]，形成脂肪条纹和引发炎症的发生，最终加剧了斑块的不稳定性。在AS斑块处，ICAM-1的表达可使白细胞聚集从而造成局部组织损伤和炎症反应。NF-κB激活是血管内皮细胞损伤的初始机制之一。NF-κB的激活会上调VCAM-1、ICAM-1和ELAM-1的表达，以介导单核细胞黏附内皮细胞并移动向内皮下；而阻断NF-κB信号通路能下调细胞因子诱导的黏附因子的表达[21]。ICAM-1和VCAM-1抗原表达可作为T淋巴细胞的共同刺激信号，进一步诱导淋巴细胞分泌炎症因子[22]。丹参酮ⅡA抑制NF-κB通路的激活，以抑制ICAM-1和VCAM-1的表达，从而达到抗AS的效果[23]。Zhang[24]研究表明NF-κB p65的敲除显著阻断了oxLDL诱导的内皮细胞的凋亡和Caveolin/NF-κB/HMGB1信号通路参与了损伤内皮诱导巨噬细胞迁移的过程。Yue等[25]实验证明炎症因子IL-6可通过P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信号通路增加了内皮细胞的内皮脂肪酶(EL)的表达和增殖从而参与了动脉粥样硬化的发生。王启章[26]研究表明P38MAPK信号通路抑制剂可通过抑制NF-κB 的DNA结合活性，进而抑制内皮炎症反应和氧化应激，改善内皮损伤。ApoE-/-小鼠的研究表明，miR-181b模拟物能降低血管内皮细胞的动脉NF-κB活化和NF-κB调节的基因表达，导致白细胞积聚和动脉粥样硬化的减少[27]。因此，抑制黏附分子的上调和抑制单核细胞对内皮的黏合是治疗动脉粥样硬化的新型治疗策略。

3.2NF-κB与血管平滑肌细胞和细胞外基质 随着炎症过程的延续，细胞凋亡和基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)降解细胞外基质变得明显。动脉粥样硬化可分为稳定斑块和不稳定斑块，稳定的动脉粥样硬化斑块的特征是具有较厚由平滑肌细胞(SMC)和细胞外基质(ECM)组成的纤维帽，纤维帽主要是保护斑块免于破裂；不稳定的斑块其SMC和ECM含量较少，且具有炎症细胞和蛋白酶的分泌，这可能导致斑块表面破裂。MMP-1降解动脉粥样硬化斑块纤维帽中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、X 型胶原纤维，导致AS 斑块中纤维帽薄弱，从而使斑块易破裂，且在破裂斑块内巨噬细胞分泌的MMP-1明显比未破裂斑块增多[28,29]。当炎症细胞数量增多的时候，大量的 MMP-1 蛋白聚集，降解纤维帽的胶原纤维[30]，削弱了斑块的稳定性，斑块易于破裂引起急性冠脉综合征[31]。

MMP-9可降解内皮细胞、血管平滑肌细胞外的基质和基底膜，并使弹力层间隙增宽，增强血管通透性，进而损伤内皮的功能，影响内皮的生理舒张调节。研究表明MMP-9 蛋白表达增加，其斑块损伤明显增加，应用他汀类药物可明显降低MMP-9 表达水平，减少动脉粥样硬化斑块基质成分降解和炎症反应，达到了稳定斑块的作用[32]。Nakashima等[33]研究表明，NF-κB激活后发挥基因调控作用，使MMPs 表达上调，炎症反应增强，最终导致 As与不稳定性斑块的形成。动脉粥样硬化中NF-κB显著激活，增加ICAM-1、MMP-9的表达，促进内皮细胞炎症发生[34]。因此，抑制NF-κB信号通路，可减轻动脉粥样硬化炎症的发生。Mi等[35]在对比腹主动脉瘤、人类胸主动脉瘤与正常主动脉组织中发现骨桥蛋白会通过NF-κB通路上调MMP-2、MMP-9的表达，从而促进细胞外基质的降解和主动脉瘤的发生。Zhang等[36]实验证明了TGF-β1刺激血管平滑肌细胞表达和分泌MMP-9是通过依赖ROS的ERK-NF-κB 信号通路从而起到作用。

3.3NF-κB与巨噬细胞 巨噬细胞是动脉粥样硬化中又一关键因素。巨噬细胞促进动脉粥样硬化紧张，而分解巨噬细胞可抑制斑块的进展和促进斑块修复，通过分泌细胞因子、蛋白酶等，炎性巨噬细胞增加病变细胞的扩张，并引起斑块破裂和急性腔内血栓的形成[37]。促炎性巨噬细胞(M1)促进斑块坏死和分泌MMPs来降解纤维帽是其加速AS进展的两大关键[38]。同时，M1具有增加单链小分子RNA——microRNAs(miRNAs)的作用，如增加miR-33s的表达。miRNAs参与炎症因子的表达和调控脂质代谢，从而参与As的形成，miR-33s的主要靶基因是三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)。研究表明，抑制miR-33s表达，可促进ABCA1表达和胆固醇逆向转运，并明显减少斑块面积[39]。研究表明NF-κB在急性冠状动脉综合征和不稳定型心绞痛患者的外周血单核细胞和损伤巨噬细胞中被激活[40]。载脂蛋白E(ApoE)增强单核细胞和巨噬细胞中的microRNA-146a表达，从而抑制NF-κB介导的细胞活化，以响应通过TLR受体(包括高脂血症)的急性和慢性炎性信号传导[41]。LPS激活的TLR4/NF-κB信号通路有助于脂肪分化相关蛋白(ADRP)依赖的外膜成纤维细胞中的脂质沉积，其加速了单核细胞募集和脂质体巨噬细胞泡沫细胞的产生[42]。NF-κB依赖性P-选择蛋白的释放也有助于巨噬细胞泡沫细胞的形成[43]。IL-1β，一种与动脉粥样硬化相关的炎症因子，研究表明其主要通过活性氧(ROS)和NF-κB途径下调巨噬细胞ABCA1的表达[44]。Li[45]已经证明TLR4/MyD88/NF-κB和SCAP/SREBP-2两条相互联系的信号通路通过上调LDL受体表达增强了LPS诱导的巨噬细胞胆固醇积聚。

3.4NF-κB与T细胞 动脉粥样硬化起始于单核细胞/巨噬细胞的募集和活化的先天免疫反应，随后涉及抗原特异性T淋巴细胞的适应性免疫应答[46]。单核白细胞存在于动脉粥样硬化各个阶段中[47]，单核细胞和T淋巴细胞黏附于动脉粥样硬化血管表面，它们沿着表面扩散迁移进入动脉内膜[48]，并分化成巨噬细胞，吞噬脂蛋白形成泡沫样细胞[2]。CD4+CD25+调节T(Treg)细胞和T辅助17(Th17)细胞在AS中起重要作用[49]。Treg具有维持自身和非自身抗原免疫耐受能力，并能预防各种免疫炎性疾病的发展。在动脉粥样硬化病变中发现Treg细胞明显减少。Treg可以抑制M1巨噬细胞的分化，并诱导巨噬细胞分化为M2巨噬细胞[50]。树突状细胞(DCs)在形成泡沫细胞后维持其抗原呈递功能并激活T细胞。高胆固醇血症能诱导T细胞向Th1或Th17细胞分化。脂蛋白代谢和胆固醇平衡发生变化可能会改变肝脏产生Treg和Th细胞亚群的比例，从而改变进入斑块的细胞比例[51]。Li[49]通过蛋白质印迹分析了NF-κB(P65)的核易位结果展示对于用不同剂量的oxLDL处理的对照组中，NF-κB(P65)核易位增强，Th17细胞也增殖，此外，用NF-κB抑制剂——PDTC预处理组结果显示抑制了Th17细胞的增殖。此次结果证明了Th17细胞的增殖可能是通过NF-κB的相关途径来介导。CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞可能部分通过TLR2-NF-κB信号通路，对OxLDL诱导巨噬细胞的促炎特性发挥抑制作用[38]。最近一项体外研究表明：SPMs能抑制人T细胞分化为具有细胞效应的Th1和Th17细胞；同时阻断Teff细胞分泌炎症因子(IFN-g)，同时活化Treg细胞，在SPM缺陷的Elovl2小鼠中，淋巴组织中具有更多的Th1和Th17细胞，并且比对照小鼠具有更多的Treg细胞[52]。因此，诱导Treg细胞活化可能是治疗AS的新型治疗策略。

3.5NF-κB与其他细胞 除了以上细胞，树突状细胞(DC)也可以在动脉粥样硬化病变中被发现，并导致动脉粥样硬化。在健康的动脉中，只检测到少量不成熟的DC。在动脉粥样硬化发展过程中，不成熟的DCs发育成熟，数量急剧增加。它们通过促进脂质积聚，抗原呈递，细胞因子产生，趋化因子产生和第三级淋巴器官形成而参与动脉粥样硬化从脂肪条纹到成熟病变的所有阶段[53]。在抗原暴露时，DC上调Ⅱ类主要组织相容性复合物(MHCⅡ)和共刺激分子如CD40、CD80和CD86。抗原被内化在DC中，随后通过MHC复合物呈递，从而激活T细胞[54]。适应性免疫在动脉粥样硬化中起关键作用。DCs是协调适应性免疫的关键作用的专职抗原呈递细胞。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)可以激活DC并引发适应性免疫反应。VSMC以AT1受体/ NF-κB方式响应AngⅡ表达TSLP[55]。Zhao[56]实验证明AngⅡ诱导TSLP的表达，从而通过触发DC诱导Th17细胞的分化而增强了动脉粥样硬化的免疫反应；NF-κB抑制剂PDTC和AT1受体拮抗剂缬沙坦均显著抑制AngⅡ诱导的VSMCs的TSLP产生和DC活化。Gao[57]研究表明成熟的DCs通过膜TNF-α介导的NF-κB途径增加内皮炎症和动脉粥样硬化。

在动脉粥样硬化斑块中，肥大细胞形成炎性细胞浸润的一部分，并定位于纤维帽的脆弱边缘区[58]。研究显示特异性MC缺陷显著减少小鼠动脉粥样硬化[59]。经典的MC活化通过交联与IgE结合的高亲和性FcεRI受体而发生[60]。Toll样受体(TLR)触发另一种MCs激活途径，TLR4信号级联下游介质NF-κB(p65)的激活诱导许多促炎性细胞因子的表达。TLR4拮抗剂在小鼠ApoE-/-被证明对在斑块中已存在MCs的没有影响，而是减少病灶衍生MCs的活化，提示MCs易受TLR4活化的影响。此外，MCs特异性激活诱导动脉粥样硬化斑块内存在的血管平滑肌细胞的凋亡，这一过程可被TLR4拮抗剂抵消，表明TLR4介导的MCs活化参与了诱导血管平滑肌细胞凋亡[61]。Leskinen[62]研究表明，肥大细胞分泌的糜蛋白酶可以通过破坏NF-κB介导的生存信号通路来介导SMC细胞凋亡。因此，存在于动脉粥样硬化斑块易损区域中的局部激活和脱颗粒的肥大细胞可以通过诱导相邻SMC的细胞凋亡而参与减弱斑块的稳定性。Meng[63]用ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和NF-κB抑制剂(p65)预处理人肥大细胞，结果显示能显著减弱肥大细胞中ox-LDL诱导的炎症反应。Ox-LDL可能通过NF-κB刺激肥大细胞分泌炎性细胞因子，部分依赖于TLR4介导的Myd88依赖性信号传导。

许多嗜中性粒细胞功能起源于通过受体介导的信号，如TLRs、NOD样受体、C型凝集素受体和RIG-Ⅰ样受体[64]。嗜中性粒细胞是另一种涉及动脉粥样硬化的细胞类型。这些粒细胞是第一个对不同抗原产生反应的细胞，嗜中性粒细胞通过分泌大量炎症介质如白三烯以及激活内皮细胞的嗜中性粒细胞胞外诱集剂(NETs)来启动炎症反应。

4 临床药物对NF-κB的影响

上文阐述了NF-κB与动脉粥样硬化的关系，现在总结临床药物对NF-κB的影响从而更好地了解新的治疗方法。Caliceti[65]首次证实了小檗碱可以阻止oxLDL和TNFα诱导的oxLDL受体-1(LOX1)表达和氧化应激从而抑制MAPK/Erk1/2和NF-κB激活。Song[66]提示TLR4通过激活NF-κB调节Ox-LDL诱导的VSMC钙化，突出了TLR4/NF-κB信号通路在血管钙化中的关键作用，而NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)减弱了Ox-LDL诱导的VSMC钙化。丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)的抗炎/抗动脉粥样硬化作用机制，可能通过部分阻断TNF-α诱导的NF-κB激活和通过抑制EPCs中的IKKα/β途径使IκB-α磷酸化而下调VCAM-1和ICAM-1[67]。上面的研究表明了抑制NF-κB一般都会减弱动脉粥样硬化的发展，但Chen的研究给出了不一样的答案。Chen[68]证明了没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)增加了NF-κB亚基p50和p65从细胞质到细胞核的易位，增强了NF-κB的DNA结合活性，从而抑制清道夫受体(SR-A)启动子活性。NF-κB抑制剂Bay阻断EGCG对SR-A表达的抑制。目前的研究结果表明，EGCG调节NF-κB活性，从而抑制SR-A表达，oxLDL摄取和泡沫细胞形成。因此，一种潜在的治疗AS的可行策略是以特异性方式抑制NF-κB的活化。

5 展望

NF-κB 是一个重要的免疫反应调节子，对内皮细胞损伤、斑块不稳定的影响、脂质蓄积和炎性反应都有很大的影响，并参与固有免疫反应和适应性免疫反应。NF-κB几乎参与了动脉粥样硬化的每个阶段，通过特异性抑制剂或增强子靶向NF-κB信号传导将为抗动脉粥样硬化提供新的治疗方法。虽然NF-κB是动脉粥样硬化治疗干预的有效靶标，但也参与正常的细胞生理过程。NF-κB信号传导的全面抑制可能会导致较深的副作用，如免疫能力受损。为了减少这些有害的并发症，一种潜在的可行策略是以细胞特异性方式抑制NF-κB的活化。抑制黏附分子的上调和抑制单核细胞对内皮的黏附、增加斑块的稳定性、促进ABCA1表达、诱导巨噬细胞分化为M2型抗炎巨噬细胞和诱导Treg细胞活化可能都是治疗AS的新型治疗策略。在动脉粥样硬化中，应进一步更深入研究其特有的靶向NF-κB信号通路、特异性NF-κB亚单位或关键信号组分，开发可特异性治疗动脉粥样硬化的药物，从而减少其副作用。随着我们对NF-κB信号通路越来越了解，靶向NF-κB的选择性药物最终可能用于动脉粥样硬化疾病的临床治疗。