母婴ABO合并Rh-ccdee/ccDEe血型不合HDN实验诊断与鉴别诊断的研究

卞玉凤 楚芙蕾 苏乌德 阿依克丽木 郑琉琪 余忠清

(新疆博州人民医院输血科，博乐 833400)

新生儿溶血病(Hemolytic disease of new born，HDN)是指母婴ABO血型和Rh血型不合，导致母体血液中产生了高效价的IgG类抗体。IgG类抗体可通过胎盘屏障进入胎儿血液循环并引起胎儿或新生儿同种免疫性溶血性贫血、黄疸、水肿、肝脾肿大。严重者甚至形成胆红素性脑病，又称核黄疸而影响胎儿或新生儿大脑基底核、视丘下核、苍白球等部位病变，导致胎儿或新生儿智力低下或智障[1]。在我国人群中，ABO-HDN占85%，Rh-HDN占14.9%[2]，其他血型系统HDN仅占0.1%。近来我科在进行HDN实验诊断时，相继发现2例新疆维吾尔族女同胞母婴血型不合者。其中：例1为ABO血型不合合并Rh两座位2位点表型不合，例2为母婴A型同型，但Rh-ccdee与 Rh-CcDEe 两座位3位点表型不合的特殊病例，在既往的文献中查询，未见该病例报道。我们通过实验诊断与鉴别诊断确诊，及时为临床早期预防和治疗提供了依据，现总结并报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 例1：母，32岁，维吾尔族，新疆博乐市郊牧民。既往有妊娠史2次，2008年生产1次，2016年生产第2次、但新生儿出生1周后发生“HDN”而死亡。第3胎产1男性活婴，出生后出现黄疸，且1 d后黄疸逐渐加重，临床依据孕妇既往妊娠史和婴儿现病史作HDN相关检查与治疗。例2：母，25岁，维吾尔族，新疆精河县人。既往有妊娠史，人工流产2次，现孕3产1，待产入院。入院前该孕妇既没做孕检，也没做产前检查。入院2 d后自然分娩1女性活婴，新生儿出生后发生黄疸，全身皮肤黄染且进行性加重，并作HDN实验室检查治疗。

1.1.2试剂 ①ABO单克隆抗A/B和抗体筛选细胞均由上海市血液中心提供；Rh分型系列，由Sigma公司提供。②微柱凝胶血型卡和不规则抗体配套筛选卡均由美国强生公司中国上海分公司代理商提供。③试剂细胞A-c、B-c和O-c由新疆博州人民医院输血科血型鉴定室信息库查询，选择既往RhD阴性患者抽血，重复检测并确认。④Rh单特异性组合谱细胞：O型Rh-CCDee(Ⅱ号细胞，批号：20177036)由上海市血液中心抗筛谱细胞中挑选；A型 Rh-CCdee(批号：17176330)、O型Rh-ccdEe(批号：17205351)由武汉市血液中心输血研究所血型参比室提供，A型Rh-CcDEe为例2新生儿红细胞(由本室鉴定配制)。

1.1.3仪器 全自动血型分析仪：Ortho AutoVue®Innova，由美国强生公司引进。

1.2方法

1.2.1ABO/Rh血型鉴定 采用全自动血型分析仪自动加样、检测、扫描并判读实验结果。

1.2.2Rh分型 盐水介质试管法。

1.2.3直接抗人球蛋白实验 微柱凝胶法[3]，新生儿红细胞用生理盐水洗涤3次后，配成1%的红细胞悬液，加50 μl置微柱凝胶孔中，封口，2 000 r/min 离心10 min观察结果。

1.2.4游离实验(微柱法[3]) 取微柱凝胶卡1张，标明A、 B 、O(游离抗体)字样和新生儿信息及检测日期，将患儿分离血清取25 μl分别加入各孔中，再对应加入2%试剂红细胞悬液25 μl于各孔中，混匀，置37℃专用恒温箱孵育15 min。取出检测卡，对称平衡，离心10 min观察结果。

1.2.5放散实验 取生理盐水洗涤3次后的压积红细胞0.8 ml左右，加等量的生理盐水，于56℃水浴箱中手摇振荡放散抗体。放散振荡频率30次/min，放散6～8 min，4 000 r/min离心1 min，立即将放散液取出置另一洁净的玻璃试管中备用。取微柱凝胶卡1张，标明A、 B 、O(放散抗体)字样和患儿信息，将放散液25 μl分别加入各孔中，下同1.2.4游离试验操作步骤。

1.2.6抗体性质测定及确认 盐水介质试管法和微柱凝胶法。用婴儿2 A型Rh-CcDEe红细胞与其母抗凝血浆反应，肉眼观察试管及微柱凝胶卡中红细胞的凝集强度。当试管中红细胞发生凝集时表明有IgM抗体，并用Rh组合谱细胞鉴定抗体的种类，同时用对应的Rh谱细胞将IgM抗体吸收后再监测IgG抗体并确认。

1.2.7HDN实验诊断标准[1]①母婴ABO/Rh血型不合；②DAT阳性；③抗体放散阳性；④婴儿伴高胆红素血症。

2 结果

2.1母婴 ABO/Rh血型及不规则抗体鉴定 结果见表1。

2.2母抗体特异性鉴定 母1鉴定为IgG抗A合并IgG抗D，IgG抗E缺失；母2鉴定为IgM合并IgG类抗体，IgM为抗E、IgG为抗D，IgG抗E/抗C和IgM抗C缺失。结果见表2及图1A、B。

表1ABO/Rh血型和不规则抗体鉴定

Tab.1IdentificationofABO/Rhbloodtypeandirregularantibody

MonitoringprojectMother1Newborn1Mother2Newborn2ABO/RhbloodtypeO/Rh⁃ccdeeA/Rh⁃ccDEeA/Rh⁃ccdeeA/Rh⁃CcDEeAntibodyscreening4+4+4++AntibodypropertiesIgGIgGIgGandIgMIgG

表2抗体特异性鉴定

Tab.2Specificidentificationofantibodies

PregnantwomanA-cO/Rh⁃CCDeeO/Rh⁃ccdEeA/Rh⁃CCdeeConclusionMother1plasma++-0IgGanti⁃AplusIgGanti⁃D(IgGanti⁃Edificiency)Mother2plasma0++-IgGanti⁃DplusIgME(IgGanti⁃E/anti⁃CandIgManti⁃Cdificiency)

表3抗体效价测定

Tab.3Antibodytiterdetermination

PregnantwomanIgGanti⁃AIgGanti⁃DIgGanti⁃EIgManti⁃EIgGanti⁃CIgManti⁃CMother1plasma256128-000Mother2plasma0128-64--

表4ABO和Rh-HDN实验诊断

Tab.4ABOandRh-HDNexpreimentaldiagnosis

NewbornFreetestAcBcOcDATSecondantibodyDispersiontestAcBcOcExperimentaldiagnosisWaitingfordischargeBaby14+4+4+4+4+4+4+ABOincorporatesRh⁃HDN？Babygirl2+++4+4+4+4+Rh⁃HDN(mixedtypeofRhantibody？)

Note： Boys 1 Ac,Bc and Oc were all agglutination(+),The ABO plus Rh D HDN,and must be differential diagnosis.

表5ABO和Rh-HDN鉴别诊断

Tab.5ABOandRh-HDNdifferentialdiagnosis

NewbornFreetestA-1cB-cO-cDispersiontestA-1cB-cO-cRhantibodyspecificityA/Rh⁃CCdeeO/Rh⁃ccdEeO/Rh⁃CCDeeDifferentialdiagnosisBaby1±±-4+2+-000ABOplusRh⁃HDNBabygirl2000000--4+Rh⁃HDN(Anti⁃Eand⁃Cdeficiency)

Note：The B-c(±) and (2+) agglutination in free and dispersion tests are caused by the anti(A+B) complex antibody.

图1 抗体特征与特异性鉴定Fig.1 Antibody characteristics and specificity identificationNote:Tube 1(Brine method):Mother 2 anticoagulation plasma and infant 2 A/Rh-CcDEe erythrocyte immune response(+);Tube 2(Brine method):Maternal 2 anticoagulant plasma and O-type Rh-ccdEe spectrum cells had an immune response(+).

2.3母抗体效价监测 结果见表3。

2.4婴儿ABO及Rh-HDN实验诊断 结果见表4。

2.5ABO及Rh-HDN鉴别诊断 用A-c、B-c和O-c阴性红细胞，鉴别放散液中对应的抗体；用A型Rh-CCdee、O型Rh-ccdEe和O型Rh-CCDee组合谱细胞鉴别放散液中特异性IgG抗体，结果见表5。

3 讨论

人类共有30个血型系统，与HDN相关的血型系统，包括ABO、Rh、MNSs、Kidd、Kell、Diego和dufyy等。其中ABO血型不合HDN在临床上最常见，Rh-HDN次之，其他血型系统HDN较为罕见。ABO HDN一般发生在母亲为O型，胎儿或新生儿为A或B型者，也可发生在母亲为A或B型而胎儿或新生儿为B或A型及AB型中[4]。当母体IgG抗A(B)效价>64时，胎儿红细胞可能发生损伤或破坏。当IgG抗A/B效价>256且持续升高者，胎儿可发生较重的HDN[5]。

Rh-HDN在我国人群中少见，但在新疆维吾尔族人群中多见。Rh溶血症状较ABO-HDN重，且实验诊断较为复杂，尤其是多位点表型不合的HDN实验诊断与鉴别诊断难度较大。Rh组合谱细胞寻找也很困难。Rh血型系统有抗原5种，在Rh座位上分别由2个高度同源紧密连锁的结构基因RhD和RhCE串联排列组成[6]。RhD基因编码D抗原，RhCE基因编码C、c、E、e 4种抗原[7]，其抗原性依次为D>E>c>C>e[8]。RhD座位有2种表型，RhCE座位有CE、Ce、cE和ce 4种表型，共组成8种单倍体遗传给子代。当母婴Rh多位点表型不合时，母体易产生多种Rh类抗体。Rh抗体包括抗D、抗E、抗C、抗c、抗e[9]，在既往文献报道中还有复合抗cE等4种复合抗体引起HDN[9-11]。其中以抗D抗体最多，抗E次之，抗c、抗C、抗cE及其他复合抗体较为少见。当母体血液中Rh类抗体效价≥1∶16时，胎儿或新生儿可引发Rh血型不合的新生儿溶血病。故母婴血型不合是高危妊娠的一种，可引起早期习惯性流产，早产或中晚期死胎[12]。

在本文研究中，我们偶遇1例母婴O-A血型不合重叠Rh-ccdee/ccDEe两座位2位点表型不合者，用O型Rh-CCDee和O型Rh-ccdEe组合谱细胞对母1抗体特异性鉴定，我们发现母1血清与O型Rh-CCDee细胞(微柱法)发生凝集反应(4+)、与O型Rh-ccdEe细胞则不发生凝集反应(-)。表明母1不规则抗体中有IgG抗D而无IgG抗E。由于母婴1 ABO血型也不合，故我们又用A-c阴性细胞对母1进行了抗体的定性与效价监测，结果母1有IgG抗A产生，其效价为256，IgG抗D效价为128，见表1～3。由此可知：母1 IgG抗A合并了IgG抗D。随后对婴儿1 HDN实验诊断，游离A1c/Bc/Oc均为强阳性(4+)、直接抗人球蛋白试验强阳性(4+)、放散Ac/Bc/Oc也均为强阳性(4+)。由此可知：婴儿1有ABO合并Rh-HDN可能，但须经A-c/B-c/O-c细胞鉴别诊断才能得出准确的结论，见表4。我们从Rh信息库中筛查，获取了A-c/B-c/O-c细胞，并对婴儿1进行了鉴别诊断。在游离试验中A-1c/B-c细胞均为弱阳性反应(±)，但O-c为阴性反应(-)；在放散实验中：A-c/B-c均为强阳性(4+/2+)，O-c也为阴性反应(-)。由此可以鉴别诊断：婴儿1为ABO合并Rh-HDN(抗A及抗D交叉混合型)，与其母抗体鉴定结果完全相符，见表4、5。ABO合并Rh-HDN，有文献报道[13]胎儿ABO血型与母体不合时，可以减少Rh-HDN的发生。这是由于胎儿红细胞进入母体血循环后，因为Rh血型不合受到孕妇体内抗A、抗B的破坏，从而减少了Rh抗原的免疫作用。在本文研究中，母1为孕3产2，在既往第2次妊娠第1次分娩时，婴儿出生1周后发生“HDN”死亡，这可能与高效价的Rh抗D重叠ABO抗A交叉合并溶血相关联。对此，我们认为：尽管ABO合并Rh可能会减少Rh抗原的免疫作用，但胎儿红细胞一旦进入母体血流时，记忆性B淋巴细胞在瞬间识别且同时释放Rh抗体的免疫效应和溶解红细胞膜碎片刺激母体产生抗体的风险依然存在，其抗D含量或效价不能低估。通过对母1第3次妊娠第2次分娩时抗体监测，其抗A效价为256，抗D效价128，这一研究结果与文献报道存在一定的差异[13]。因此，我们认为：母婴ABO合并Rh血型不合时有可能加重HDN的临床症状。鉴于母1既往发生“HDN”而死亡，故临床采用O型RhD阴性红细胞对新生儿进行了换血治疗，同时结合蓝光照射对症治疗，婴儿1救治及时而成活，至今生长发育良好。

对母2的监测，母婴Rh-ccdee与Rh-CcDEe 2座位3位点表型不合，且母2孕3 产1，究竟能产生那些抗体？抗体性质如何？在既往的文献中查询未见类似报道。从母婴2 Rh分型及抗体的产生规律来看，该孕妇可产生IgG抗D、抗E、抗C，甚至抗CE等混合性抗体。这些IgG抗体分子均可进入胎儿血液循环同时吸附在胎儿红细胞膜上，并可加重Rh-HDN的临床症状(抗体混合型)。由于试验中母2抗筛(4+)，婴儿2抗筛(+)，故我们将母2 A型血浆(清)用盐水法与婴儿2 A型Rh-CcDEe红细胞反应，经试管法离心后发现肉眼可见的凝集现象(+)，见图1A。由此证实：母2血清中存在IgM类抗体。我们又用单特异性O型Rh-ccdEe、A型Rh-CCdee组合细胞分别与其母血清反应，结果 O型Rh-ccdEe发生凝集反应(+)、A型Rh-CCdee则无凝集反应(-)，见表2及图1。由此可以判断母2 IgM为抗E、IgM抗C缺失。IgM抗C缺失可能与CE座位E的免疫原性强于C相关联，即E抗原掩盖了C抗原的免疫作用；继续用O型Rh-ccdEe细胞将母2 IgM抗E在室温条件下吸收10 min后，再离心取上清液分别与O型Rh-ccdEe、A型Rh-CCdee、O型Rh-CCDee谱细胞用微柱法监测母2血浆中IgG抗E、 IgG抗C和IgG抗D。结果显示：母2 IgG抗E和IgG抗C均为阴性(-)，与“RhD阴性人群在随机输血(或妊娠)水平上C抗原刺激机体产生相应的IgG抗体可能性最大”存在差异[14]、IgG抗D为阳性(+),其效价为128，IgM抗E效价64，结果见表2、3。故母2血液中仅有IgM抗E合并IgG抗D(抗体混合型)。由于IgM抗E仅存于母体血液中，对胎儿来说这又可减轻Rh-HDN的临床症状，但CE复合体免疫其母产生IgM抗E的分子机制目前还不够清楚，文献也未见报道，尚需我们今后进一步探讨与研究。通过对婴儿2对比监测，婴儿2游离抗体均为阳性(+)，直接抗人球蛋白试验和放散试验均为强阳性(4+)，因此，婴儿2 Rh-HDN成立。但婴儿2血液中究竟有没有混合性抗体合并存在？我们又用A型Rh-CCdee、O型Rh-ccdEe、O型Rh-CCDee组合谱细胞分别与其放散液用微柱法作鉴别诊断，结果显示：A型Rh-CCdee和O型Rh-ccdEe细胞与放散液均不发生凝集反应(-)、仅与O型Rh-CCDee发生凝集反应(4+)，监测结果表明：婴儿2放散液中仅有IgG抗D存在，而无IgG抗E及抗C，监测结果与母2相符合，结果见表4、5。据此，我们可以得出鉴别诊断结论：婴儿2为Rh抗D-HDN(单一型)。由于婴儿2黄疸指数<342 μmol/L，故临床采用蓝光照射和肝酶诱导剂治疗，黄疸指数逐渐下降，住院15 d后痊愈出院，治疗效果良好。

总之，母婴ABO合并Rh-ccdee/ccDEe两座位2位点表型不合和Rh-ccdee/CcDEe两座位3位点表型不合HDN的实验诊断与鉴别诊断较为复杂，临床也未见报道。因此，我们认为对于ABO血型不合合并Rh表型不合的HDN，必须用A-c/B-c/O-c 3种阴性红细胞和Rh组合谱细胞加以鉴别诊断，才能较好的完成母婴ABO合并Rh的鉴别检验程序；对于Rh两座位3位点表型不合的HDN，同样需要多个Rh组合谱细胞鉴别诊断，方能区分母婴Rh类抗体性质和混合型抗体种类以及抗体的含量对Rh-HDN的严重程度，为临床HDN早期诊断、精准治疗提供可靠的实验依据，从而进一步提升我国优生优育的综合诊疗水平。