双侧颈总动脉结扎致血管性痴呆大鼠模型研究进展

孟敏，李林

首都医科大学宣武医院药物研究室，北京市神经药物工程技术研究中心，神经变性病教育部重点实验室，北京市100053

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是指由缺血性脑卒中、出血性脑卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征[1]。由于脑的能量主要来源于葡萄糖有氧代谢，几乎无能量储备，脑组织对缺血缺氧性损害非常敏感。脑组织缺氧后，由于能量耗竭等多种因素，引发神经细胞肿胀、变性、坏死、凋亡，以及胶质细胞肿胀、增生等，尤其以神经元死亡和进行性受损为显著特征[2]。

为了理解脑血管疾病在认知功能障碍和痴呆发展过程中的作用，复制慢性脑血流灌注不足导致的人类痴呆，建立了永久性双侧颈总动脉结扎动物模型。大鼠是永久性双侧颈总动脉结扎模型经常使用的动物，具有生存率高、术后恢复速度快、行为学测试简单的特点[3]。大鼠基底动脉环比较完整，可以在结扎后为大鼠脑部提供脑血流，但血流量减少，因此可作为脑低灌注动物模型[4]。小鼠由于基底动脉环中的后交通静脉缺乏或发育不全，永久性双侧颈总动脉结扎术后会引起严重脑缺血，很容易发生震颤、运动障碍甚至死亡。此外，制备大鼠模型手术操作简单，不需要低血压或低氧的外界条件；由于是全脑缺血，不会引起明显运动障碍[5]。

大鼠施行永久性双侧颈总动脉结扎后，会出现脑血流量减少、学习和记忆功能障碍、神经元损伤及死亡、突触及树突损伤，以及神经炎症反应等[6-7]。

1 脑血流量减少

1.1 多通道激光多普勒血流仪检测

已经有研究表明，人脑血流量减少会引起认知障碍和痴呆[8-9]。本实验室应用多通道激光多普勒血流仪检测大鼠双侧颈总动脉结扎术后10 min脑血流量[10]，发现各脑区血流量与术前相比，皮层额区减少67.83%，顶区减少56.82%，Mynert基底核减少51.21%，尾壳核减少41.18%，海马CA1区减少51.83%，CA2区减少41.21%，枕区减少16.16%，表明大鼠双侧颈总动脉结扎后与学习记忆相关的脑区血流量均显著下降。另有研究检测大鼠永久性双侧颈总动脉结扎术后2.5 h～6个月特定脑区的局部脑血流量，结果显示脑皮质区和白质的血流量显著减少[11-13]。

1.2 MRI灌注加权成像(perfusion weighted imaging,PWI)检测

有研究者使用MRI PWI技术，利用快速扫描技术和团注顺磁性对比剂反映脑微血管内血流动力学变化，发现额叶皮质和海马区局部脑血流量和局部脑血容量随时间延长而降低[14]。脑血流量降低，引起脑内葡萄糖代谢减缓[12,15]，ATP酶活性降低，海马和皮质等区域乳酸含量增加[16]。随着造模后时间延长，大鼠脑血流量有如下改变[17]：术后2～3 d，大鼠脑血流量急剧减少；1周后脑血流量开始恢复，但术后4周时仍低于对照组；术后8周～3个月，脑血流量恢复至与对照组仅有轻微或无差异的水平；术后3～6个月为脑组织代谢的代偿期。另有研究显示[18-19]，术后6个月，脑血流量与对照组已无显著性差异。

2 学习记忆功能障碍

2.1 Morris水迷宫检测

长期脑血流灌注不足可引起痴呆并加速痴呆进展[20-21]。在动物实验中，常采用Morris水迷宫或八臂迷宫检测永久性双侧颈总动脉结扎动物模型的空间学习记忆障碍[8,22]。很多研究表明，双侧颈总动脉结扎模型大鼠与正常对照组相比，Morris水迷宫逃避潜伏期延长[5,16,23-24]，八臂迷宫错误次数增多[11]。Morris水迷宫时程研究发现，术后4周，模型大鼠学习记忆能力明显降低；随着时间延长，学习记忆能力没有恢复的趋势[25-26]。

2.2 其他行为学检测

本实验室研究表明[5,27]，大鼠双侧颈总动脉结扎术后1个月、2个月和4个月，通道式水迷宫试验显示游出时间延长，错误次数增多。术后1个月旷场试验结果表明[5]，中央格停留时间延长；术后4个月，模型组停留时间明显超过对照组。也有研究者采用跳台试验检测大鼠的认知功能[14]，造模后15 d、30 d、45 d，学习记忆能力都有所下降，提示随着结扎时间延长，认知损害加重。

这些结果表明，大鼠永久性双侧颈总动脉结扎所致慢性脑血流量灌注不足，可引起学习记忆功能损害，且持续较长时间，是比较理想的血管性痴呆动物模型。

3 神经元损伤及死亡

学习记忆能力的强弱与海马区密切相关；同时，海马区也是对缺血最敏感的区域，缺血引起海马区神经元损伤，进而导致认知功能障碍。应用尼氏染色检测神经元损害，观察到在永久性双侧颈总动脉结扎术后2周，6%～29%动物出现海马CA1区神经元损伤[28-30]；术后4周，出现上述损伤的动物超过50%；术后8～13周，观察到2/3大鼠整个海马区神经元损伤[31]。本实验室应用尼氏染色检测的结果表明[14,27]，大鼠双侧颈总动脉结扎术后48 h和96 h，出现海马区锥体细胞胞浆内尼氏体减少或缺失，并出现凋亡小体；术后30 d海马锥体细胞密度轻度减低；术后60 d细胞核固缩深染，细胞密度显著减低，表明有大量海马锥体细胞死亡。

有研究者通过免疫荧光，进行神经元标记物NeuN染色，发现模型组NeuN阳性细胞数减少[32]。术后4周模型大鼠免疫组化实验表明[33]，海马区c-Fos蛋白升高，能够阻断细胞内信号转导，进而产生促凋亡因子，促进细胞凋亡。

4 神经突触损伤

在神经退行性疾病中，神经突触的减少是神经元损伤的明显标志[34]。电镜观察海马神经突触，发现永久性双侧颈总动脉结扎术后30 d，模型大鼠海马突触前和突触后成分肿胀明显，突触间隙模糊不清，突触前成分内的突触小泡减少，突触后成分内的致密物质变薄[35]。脑血流量不足会影响突触间联系。

4.1 突触囊泡膜的改变

突触蛋白Ⅰ(synapsin I)是一种相对分子量38 kDa的钙离子结合糖蛋白，特异性位于轴突末端突触前囊泡膜上，是囊泡膜的标志。Western blotting检测发现，永久性双侧颈总动脉结扎模型大鼠海马区突触蛋白Ⅰ表达减少[35]。

突触素(synaptophysin)是突触囊泡膜蛋白，分布于突触前囊泡膜上，是突触囊泡的标志，能够构成囊泡特异性通道，在突触囊泡的转运及其内容物释放过程中发挥重要作用，参与钙离子依赖的神经递质释放和突触囊泡循环[36]。大鼠永久性双侧颈总动脉结扎术后30 d，海马区突触素含量减少，神经末梢出现病理损伤；Morris水迷宫试验显示，模型大鼠学习记忆能力障碍，提示认知功能障碍与突触素含量下降密切相关[34]。

4.2 突触后膜的改变

突触后致密物蛋白质-95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)位于突触后膜，是最丰富的突触后膜蛋白，在突触发育和功能中起重要作用，参与调节谷氨酸受体相关信号转导[37-39]。Western blotting检测显示，永久性双侧颈总动脉结扎模型大鼠海马区PSD-95表达明显减少[35-36,39-40]。

5 树突损伤

微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)是与树突相关的细胞骨架蛋白，主要表达于神经元胞体、树突、树突棘，与突触后膜骨架上一些信号蛋白和膜受体相连，是许多神经信号传导通路的底物，调节神经元突触可塑性和细胞骨架动力学，被认为是一种脑缺血损伤的标志[41-42]。有研究显示[43]，模型大鼠海马CA1区和CA3区MAP-2表达降低，MAP-2与大鼠学习记忆能力密切相关。Western blotting检测，发现模型大鼠海马MAP-2表达量仅为对照组的72.4%[40]。本实验室的研究表明[44]，永久性双侧颈总动脉结扎术后8周，模型大鼠海马区蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)和MAP-2表达减少，学习记忆能力降低；灌胃给予二苯乙烯苷可逆转上述变化。

6 神经炎症反应

6.1 星形胶质细胞

星形胶质细胞作为中枢神经系统固有的免疫效应细胞，参与炎症反应，已引起人们广泛关注。脑缺血可引起星形胶质细胞激活，免疫组化法可观察到胶质细胞增多和肥大[45]。神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞的标志蛋白，研究显示，脑缺血模型大鼠GFAP阳性细胞肿胀，突起变粗，分支减少[46]。永久性双侧颈总动脉结扎术后2个月，大鼠海马CA1区可检测到星形胶质细胞增生[11,47-48]。

6.2 小胶质细胞

小胶质细胞在缺血情况下会加速活化。虽然它可以参与神经组织防御，但也可能转变为毒性细胞[49]。脑缺血1～4个月，皮层、胼胝体等部位小胶质细胞聚集，数量增多[50]。由于激活的胶质细胞能产生大量炎症介质，进一步刺激胶质细胞活化、增生，从而加剧炎症反应，形成恶性循环，加重神经元损伤和死亡。

7 小结

大鼠永久性双侧颈总动脉结扎后，引起多个脑区慢性血灌注降低，尤其是海马区低灌注，导致神经元损伤及死亡、突触及树突损伤，以及神经炎症反应等，最终造成学习记忆功能下降，这些接近于人类血管性痴呆的病理改变和临床症状。与其他动物相比，大鼠价格便宜，来源充足，脑血管结构和生理特征与人类相似，在社会伦理上容易为人们所接受。因此，大鼠永久性双侧颈总动脉结扎模型是一种能够探究血管性痴呆发病机理、检测药物治疗效果的动物模型，对血管性痴呆疾病的研究具有重要意义。

随着多学科交叉，更多研究者采用MRI、正电子发射计算机断层等影像学手段监测大鼠血流量改变，用免疫组化染色、免疫荧光等为模型的评判提供依据。相信随着医学影像学技术和分子生物学技术的蓬勃发展，永久性双侧颈总动脉结扎模型的各种病理特征会被研究得更加清楚，从而促进血管性痴呆的治疗药物研发。

[1]王艳,王玉娇,谢道俊,等.血管性痴呆动物模型的实验研究进展[J].中医药临床杂志,2015,27(11):1616-1619.

[2]陈志强.缺血性脑血管病的研究进展[J].亚太传统医药,2010,6(7):159-162.

[3]谭洁,韩国栋,张泓,等.改良大鼠双侧颈总动脉结扎方式建立血管性痴呆模型的评价研究[J].中国康复医学杂志,2017,32(3):264-268.

[4]Li N,Gu Z,Li Y,et al.A modified bilateral carotid artery stenosis procedure to develop a chronic cerebral hypoperfusion rat model with an increased survival rate[J].J Neurosci Methods,2015,255(30):115-121.

[5]李斌,刘汇波,郭德玉,等.双侧颈总动脉结扎大鼠行为学观察[J].中国实验动物学杂志,2000,10(1):18-21.

[6]Buckley E,Patel S,Miller B,et al.In vivo monitoring of cerebral hemodynamics in the immature rat:effects of hypoxia-ischemia and hypothermia[J].Mol Neurodegener,2015,37(4-5):407-416.

[7]Melo M,Gadelha D,Mascena G,et al.Learning and survival memory undergoing a permanent bilateral carotid ligation in rats[J].Acta Cir Bras,2013,28(2):102-105.

[8]Brown W,Thore C.Review:cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration[J].Neuropath Appl Neurol,2011,37(1):56-74.

[9]高凤超.血管性痴呆危险因素及发病机制的研究进展[J].医学综述,2014,20(6):1068-1071.

[10]叶翠飞,白容,刘汇波,等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆相关脑区血流量的影响[J].中国实验动物学报,1999,7(1):26-28.

[11]Barros C,Ekuni R,Moro M,et al.The cognitive and histopathological effects of chronic 4-vessel occlusion in rats depend on the set of vessels occluded and the age of the animals[J].Behav Brain Res,2009,197(2):378-387.

[12]Kim S,Cho K,Kim S.The plasticity of posterior communicating artery influences on the outcome of white matter injury induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats[J].Neurol Res,2009,31(3):245-250.

[13]Melo MC,Gadelha D,Mascena GV,et al.Learning and survival memory undergoing a permanent bilateral carotid ligation in rats[J].Acta Cir Bras,2013,28(2):102-105.

[14]张岚,程敬亮.血管性痴呆大鼠脑血流、行为学和形态学对比及磁共振灌注成像的应用价值[J].中国医学影像学杂志,2013,21(7):485-489.

[15]Pardon M.Stress and ageing interactions:a paradox in the context of shared etiological and physiopathological processes[J].Brain Res Rev,2007,54(2):251-273.

[16]Song H,Cheng J,Miao H,et al.Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats[J].Brain Inj,2009,23(2):146-153.

[17]Marosi M,Rakos G,Robotka H,et al.Hippocampal(CA1)activities in Wistar rats from different vendors.Fundamental differences in acute ischemia[J].J Neurosci Meth,2006,156(1-2):231-235.

[18]Choy M,Ganesan V,Thomas D,et al.The chronic vascular and haemodynamic response after permanent bilateral common carotid occlusion in newborn and adult rats[J].J Cerebr Blood F Met,2006,26(4):1066-1075.

[19]Melo MC,Gadelha D,Mascena GV,et al.Translational realistic expectations of chronic cerebral hypoxemia in rat model after bilateral commom carotid artery ligation.Neurocognitive aspects[J].Acta Cir Bras,2014,29(1):53-58.

[20]de la Torre J.Carotid artery ultrasound and echocardiography testing to lower the prevalence of Alzheimer's disease[J].J Storke Cerebrovasc,2009,18(4):319-328.

[21]Sun L,Yan M,Hu X,et al.MicroRNA-9 induces defective trafficking of Nav1.1 and Nav1.2 by targeting Navβ2 protein coding region in rat with chronic brain hypoperfusion[J].Mol Neurodegener,2015,10(1):10-36.

[22]Yang H,Liu Y,Xie J,et al.Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation on synaptic plasticity and apoptosis in vascular dementia rats[J].Behav Brain Res,2015,281:149-155.

[23]Xing M,Sun Q,Wang Y,et al.Hydroxysafflor yellow A increases BDNF and NMDARs in the hippocampus in a vascular dementia rat model[J].Brain Res,2016,1642:419-425.

[24]Tian X,Guo X,Ruan Z,et al.Long-term vision and non-vision dominant behavioral deficits in the 2-VO rats are accompanied by time and regional glial activation in the white matter[J].PLoS One,2014,9(6):e101120.

[25]吴剑芸,张韶冈,徐俊,等.双侧颈总动脉结扎对老龄大鼠学习记忆功能的影响[J].现代医院,2006,6(9):44-45.

[26]张君,程笑,杨欢,等.山奈酚对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响及机制探讨[J].中国药理学通报,2017,33(1):39-44.

[27]刘汇波,叶翠飞,李斌,等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆功能和海马组织形态学的影响[J].基础医学与临床,1998,18(4):55-59.

[28]Ma Y,Qu Y,Fei Z.Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia[J].J Neurosci Res,2011,89(7):969-978.

[29]Farkas E,Institoris A,Domoki F,et al.The effect of pre-and posttreatment with diazoxide on the early phase of chronic cerebral hypoperfusion in the rat[J].Brain Res,2006,1087(1):168-174.

[30]Vattananupon S,Chadvongvan P,Akarasereenont P,et al.Brahmi extract attenuated spatial learning and memory impairment and cell death of rat hippocampal CA1 neurons after the 2-VO induced chronic cerebral hypoperfusion[J].Siriraj Med J,2013,65:105-111.

[31]Liu J,Jin D,Xiao L,et al.Paeoniflorin attenuates chronic cerebral hypoperfusion-induced learning dysfunction and brain damage in rats[J].Brain Res,2006,1089(1):162-170.

[32]Choi DH,Lee KH,Lee J.Effect of exercise-induced neurogenesis on cognitive function deficit in a rat model of vascular dementia[J].Mol Med Rep,2016,13(4):2981-2990.

[33]吴晓光,檀荣方,杨岚,等.山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠脑组织c-fos、Bcl-2蛋白表达的影响[J].中国老年学杂志,2016,36(1):33-34.

[34]肖雁,苏艳丽,井沆,等.血管性痴呆大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化[J].临床神经病学杂志,2014,27(1):37-40.

[35]朱燕珍,何才姑,黄玉梅,等.复方丹参滴丸对血管性痴呆大鼠海马突触的影响[J].福建中医药,2016,47(3):20-21.

[36]Sinclair L,Tayler H,Love S.Synaptic protein levels altered in vascular dementia[J].Neuropath Appl Neurol,2016,41(4):533-543.

[37]Yokoi N,Fukata Y,Sekiya A,et al.Identification of PSD-95 depalmitoylating enzymes[J].J Neurosci,2016,36(24):6431-6444.

[38]Yang J,Yao Y,Wang L,et al.Gastrin-releasing peptide facilitates glutamatergic transmission in the hippocampus and effectively prevents vascular dementia induced cognitive and synaptic plasticity deficits[J].Exp Neurol,2017,287(Pt1):75-83.

[39]刘斌,刘金霞,毛文静,等.自噬对血管性痴呆大鼠海马CA1区突触素及突触后膜致密物质95表达的影响[J].第二军医大学学报,2017,38(2):206-211.

[40]Nie C,Nie H,Zhao Y,et al.Betaine reverses the memory impairments in a chronic cerebral hypoperfusion rat model[J].Neurosci Lett,2016,615:9-14.

[41]郑峰,吴家幂.微管相关蛋白-2与缺血性脑损伤[J].神经疾病与精神卫生,2005,5(2):154-157.

[42]Popp A,Jaenisch N,Witte O,et al.Identification of ischemic regions in a rat model of stroke[J].PLoS One,2009,4(3):e4764.

[43]赵晖,王少烽,张秋霞,等.丰富环境干预对慢性低灌注血管性痴呆大鼠学习记忆及突触素蛋白和微管相关蛋白的影响[J].中国康复医学杂志,2012,27(8):687-691.

[44]刘丽,李林,赵玲,等.二苯乙烯苷对慢性脑缺血大鼠学习记忆的影响[J].中国药理学与毒理学杂志,2008,22(2):108-115.

[45]Ahn H,Yoo K,Hwang I,et al.Ischemia-related changes in naive and mutant forms of ubiquitin and neuroprotective effects of ubiquitin in the hippocampus following experimental transient ischemic damage[J].Exp Neurol,2009,220(1):120-132.

[46]景玉宏,宋焱峰,王子仁.血管性痴呆大鼠星形胶质细胞增生与TNF-α的表达[J].中华神经医学杂志,2004,3(6):418-421.

[47]Bhattacharjee A,White L,Chang L,et al.Bilateral common carotid artery ligation transiently changes brain lipid metabolism in rats[J].Neurochem Res,2012,37(7):1490-1498.

[48]孙京华,钟萍.血管性痴呆炎症细胞因子[J].蚌埠医学院学报,2012,37(2):228-230.

[49]Fernandes A,Brites D.Contribution of inflammatory processes to nerve cell toxicity by bilirubin and efficacy of potential therapeutic agents [J].CurrPharm Des,2009,15(25):2915-2926.

[50]李露斯,刘之荣.大鼠慢性脑灌注不足脑内小胶质细胞活化和脑的病理改变[J].第三军医大学学报,2001,23(4):398-400.