VITEKⅡ全自动微生物鉴定系统在两种微生物鉴定中的运用

卫舒帆 刘静萍

（1 昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650032；2 云南昊邦制药有限公司，云南 昆明 650000）

近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由法国梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定系统是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一，已被许多国家定为细菌最终鉴定设备，并获美国药品食品管理局（FDA）认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性，还具有操作简便、检测速度快的特点，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。

笔者在对药品大肠埃希菌和大肠菌群检测的过程中发现，部分检测结果呈阴性的样品，有时曙红亚甲蓝琼脂平板上有粉红色菌落生长，菌落周围呈现浸润现象，与《中国药典》2010年版描述的大肠埃希菌的菌落形态相似。《中国药典》2010年版对药品中污染菌的检测鉴定主要依靠生化实验、血清学反应等，不能准确地检测出该菌株的种类，而且生化实验对于大量菌株的分类鉴定繁琐费时、准确性差；血清学检测成本高昂，且易产生交叉反应[1-6]。因此，寻找一种快速、准确且成本低廉的方法鉴定药品中污染菌株是很有必要的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品：小儿复方鸡内金散、六味地黄胶囊。

1.1.2 阳性对照菌液：大肠埃希菌（Escherichia coli）（CMCC（B）44102）。

1.1.3 培养基及主要试剂。pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（生产厂家：北京三药科技开发有限公司，批号：1212272），胆盐乳糖培养基（生产厂家：北京三药科技开发有限公司，批号：1301052），4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培养基（MUG，生产厂家：北京三药科技开发有限公司，批号：121023），曙红亚甲蓝琼脂培养基（生产厂家：北京三药科技开发有限公司，批号：121123），乳糖胆盐发酵培养基（生产厂家：北京三药科技开发有限公司，批号：121112），营养琼脂培养基（生产厂家：北京三药科技开发有限公司，批号：1303262），95%乙醇及其他试剂均为国产分析纯。革兰阴性细菌鉴定卡（生产厂家：美国BioMerieux•Inc，批号：241267940）。

1.1.4 主要仪器：VITEKⅡ全自动微生物鉴定系统，法国梅里埃；DM500光学显微镜，德国Leica；BHC-1300ⅡA2生物安全柜，苏州金净净化设备科技有限公司；L600台式低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；YXQ-LS-100SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；GZX-GF101-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；BSP-150生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌：实验所需培养皿、刻度吸管、量筒置于电热恒温培养箱中180 ℃灭菌2 h后备用。以上几种培养基按照要求配制，置于立式压力蒸汽灭菌器121 ℃灭菌15 min，冷却后备用。

1.2.2 供试液的制备：样品均为水溶性固体制剂。分别取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，用匀浆仪混匀，作为1∶10浓度供试液。取1∶10浓度供试液1 mL，加入装有9 mLpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得1∶100供试液。以此类推，制得1∶1000供试液。

1.2.3 增菌培养：取体积100 mL/瓶的胆盐乳糖培养基各1瓶，各加入10 mL供试液（相当于供试品1 g），摇匀，置30～35 ℃培养箱内培养18～24 h。

1.2.4 阳性对照试验：取体积100 mL/瓶的胆盐乳糖培养基各1瓶，各加入10 mL供试液（相当于供试品1 g），同时各加入1 mL大肠埃希菌菌液，摇匀，置30～35 ℃培养箱内培养18～24 h，作为阳性对照。

1.2.5 阴性对照试验：取体积100 mL/瓶的胆盐乳糖培养基各1瓶，各加入10 mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀，置30～35 ℃培养箱内培养18～24 h，作为阴性对照。

1.2.6 大肠菌群检查：取乳糖胆盐发酵管各3支，分别加入1∶10稀释的供试液1 mL（含供试品0.1g）、1∶100稀释的供试液1 mL（含供试品0.01g）、1∶1000稀释的供试液1 mL（含供试品0.001 g）。另取1支乳糖胆盐发酵管，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂1 mL作为阴性对照。置30～35 ℃培养箱内培养18～24 h。

1.2.7 观察：两个样品的胆盐乳糖增菌液中均有产气发酵现象，小儿复方鸡内金散的增菌液表面有一层白色菌膜。小儿复方鸡内金散的乳糖胆盐发酵管有菌生长但不产酸产气。六味地黄胶囊的1∶10浓度的乳糖胆盐发酵管有菌生长且产酸产气。

1.2.8 接种：分别取两个样品的胆盐乳糖增菌液、阳性对照液、阴性对照液各0.2 mL，接种至含5 mL MUG培养基的试管内，摇匀。同时用灭菌接种环各挑取一环两个样品的胆盐乳糖增菌液及六味地黄胶囊的1∶10浓度的乳糖胆盐发酵管培养液、阳性对照液、阴性对照液，分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基平板上。将MUG试管和曙红亚甲蓝琼脂培养基平板置于30～35 ℃培养箱内培养。

1.2.9 4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）试验和靛基质试验：根据《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢ C微生物限度检查法中，两份样品均未检出大肠埃希菌。

1.2.10 观察曙红亚甲蓝琼脂平板：曙红亚甲蓝琼脂平板于30～35 ℃培养24 h后，取出观察。可见：小儿复方鸡内金散的曙红亚甲蓝琼脂平板上有菌落生长。菌落呈粉红色，不透明，无明显暗色中心，圆形，稍凸起，表面光滑、湿润，但是无金属光泽。六味地黄胶囊的曙红亚甲蓝琼脂平板上有菌落生长。菌落呈粉红色，呈半透明状，无明显暗色中心，圆形，稍凸起，表面光滑、湿润，无金属光泽。阳性对照的曙红亚甲蓝琼脂平板上有菌落生长。菌落呈紫黑色，菌落中心呈深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。

1.2.11 分离培养：用灭菌接种环分别挑取曙红亚甲蓝琼脂平板上的典型菌落，划线接种于营养琼脂斜面上，置30～35 ℃培养箱内培养18～24 h。

1.2.12 革兰染色、镜检。小儿复方鸡内金散中的菌体特征为：革兰染色呈阴性，直杆状，周生鞭毛，常成对存在。六味地黄胶囊中的菌体特征为革兰阴性短杆菌，有鞭毛，常成对存在。

1.2.13 用VITEK Ⅱ全自动微生物鉴定系统进行鉴定：根据革兰染色、镜检的结果，从两个样品中检出的菌落均为革兰阴性杆菌，故选择革兰阴性杆菌鉴定卡。

2 结果与分析

2.1 根据鉴定报告，小儿复方鸡内金散中的污染菌的拉丁名为Pantoea spp，查VITEK 2 GN 鉴定细菌目录，中文名为泛菌属；六味地黄胶囊中的污染菌的拉丁名为Escherichia vulneris，查VITEK 2 GN 鉴定细菌目录，中文名为伤口埃希菌。

2.2 泛菌属为兼性厌氧，具有代谢和发酵类型的化能异养菌。分离自植物表面、种子、土壤和水，也可从动物和人的伤口、血和尿中分离到。

伤口埃希菌属于埃希菌属的一种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有大肠埃希菌（E.coli）、蟑螂埃希菌（E.blattae）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫尔曼埃希菌（E.hermanii）、伤口埃希菌（E.vulneris）和低活性埃希菌（E.coli inactive）。中国药典以大肠埃希菌和大肠菌群作为药品粪便污染的指示菌。

以上两类菌都属于条件致病菌，在一定条件下，如机体抵抗力下降、寄居部位发生改变或肠道菌群失调时能引起机会感染或二重感染。

3 结 论

经鉴定，两种污染菌分别为泛菌属和伤口埃希菌，均为条件致病菌。这两种细菌在药品检验过程中出现频率较高，应当在药品生产储存过程中加以重视。VITEKⅡ全自动微生物鉴定系统能够在较短的时间内，准确鉴定出污染菌的种类，成本低廉、方便快速，具有很高的实用性，对药品微生物限度检测具有重要的意义。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典,2010年版,一部,附录ⅩⅢC[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 中国药品检验标准操作规范,2010年版[S].北京:中国医药科技出版社,2010:351-407.

[3] 苏德模,马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社,2007:317-340.

[4] 赵利伟,胡朝晖,陈文聪,等.PCR-酶切技术快速鉴定军团菌[J].微生物学通报,2013,40(8):1514-1520.

[5] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准,中药成方制剂,第十四册[S].1997:9.

[6] 李卫娟,焦豫良,吕明生,等.一株产右旋糖苷酶海洋细菌的筛选鉴定[J].微生物学通报,2013,40(5):756-765.