一种检测病毒灭活血浆亚甲蓝残留量试剂盒的应用评价

（深圳市龙岗区中心血站质控科，广东 深圳 518172）

输血技术是现代医学不可缺少的重要治疗手段，但存在经输血传染的病毒性疾病的感染风险，因此，灭活血液中的病毒是临床上保障输血安全的重要措施之一[1]。当前，为增加输血安全性，减低临床输血病毒感染的风险，采供血机构主要采用亚甲蓝光化学法灭活血浆中的病毒[2]。亚甲蓝灭活血浆的亚甲蓝释放量有效浓度为1.0～5.0 μmol，以保证有效灭活病毒；在灭活病毒以后，滤除亚甲蓝需使用一次性病毒灭活过滤器，使亚甲蓝最大残留量不超过0.3 μmol/L（临床用血浆的亚甲蓝残留量），以保证大剂量输血后体内亚甲蓝的累积不会过多，从而确保用血安全[3]。亚甲蓝残留量是血站制备的血液成分病毒灭活血浆（亚甲蓝光化学法）质量监测指标之一[4]。《血站技术操作规程》（2019版）[5]介绍了采用自配试剂检测亚甲蓝残留量的方法，但自配试剂存在标准品溯源性、冰乙酸（分析纯）安全性、试剂配制耗时、试剂配制误差等问题。同时，规程规定其他经验证可使用的方法亦可用于亚甲蓝残留量的检测。本文通过对一种检测病毒灭活血浆亚甲蓝残留量试剂盒与自配试剂的比较分析，评估其可行性，报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源：我站合格库中抽取已冰冻的病毒灭活新鲜冰冻血浆和病毒灭活冰冻血浆各10袋。37 ℃水浴复溶后取样15 mL，分成两等份备用。

1.2 仪器与试剂：722G可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），亚甲蓝（天津市光复精细化工研究所），甲醇（广东光华科技有限股份公司），冰乙酸（天津市富宇精细化工有限公司），Water Oasis小柱（Waters Corporation Milford，Massachusetts USA），真空固相萃取装置-隔膜真空泵（天津市津滕实验设备有限公司），离心机（德国Sigma公司），亚甲蓝测定试剂盒（北京瑞尔达生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 试剂盒操作步骤

1.3.1.1 亚甲蓝标准品（0.5 μmol/L）：采用试剂盒配套的可追溯至企业工作标准品的校准品。精密量取亚甲蓝校准品40 μL置于一试管内，加未经亚甲蓝处理合格血浆360 μL混合后备用。

1.3.1.2 亚甲蓝质控品（0.3 μmol/L）：采用试剂盒配套的亚甲蓝质控品。精密量取亚甲蓝质控品40 μL置于一试管内，加未经亚甲蓝处理合格血浆360 μL混合后备用。

1.3.1.3 样品处理：固相萃取装置上装入3 mL SSH2P小柱数支，连接真空泵并检查抽真空效果。用3 mL R1活化小柱。在其中两只小柱中分别加入0.3 mL血浆亚甲蓝校准品和血浆亚甲蓝质控品，其余小柱中加入6 mL待测血浆。亚甲蓝残留量萃取后，用3 mL R2清洗，随后用含2 mL R3洗脱。于3500 rpm离心洗脱液5 min，取上清液作为样本溶液。

1.3.1.4 亚甲蓝含量测定：用R3作试剂空白，各管吸光度在653 nm波长处测定。根据试剂盒说明书计算公式计算测试样本亚甲蓝残留量。

1.3.2 自配试剂操作步骤：参照《血站技术操作规程》（2019版）附录F.19亚甲蓝残留量。

1.3.2.1 亚甲蓝标准浓缩储备液配制：精密称取亚甲蓝对照品粉末38.0 mg，用蒸馏水溶解并稀释至100 mL，配制成1.0 mmol/L的亚甲蓝标准浓缩储备液，避光保存。

1.3.2.2 标准品制备：紧密量取1.0 mmol/L亚甲蓝浓缩储备液50 μL，置50 mL容量瓶中，用血浆稀释至刻度，配成亚甲蓝浓度为1.0 μmol/L的亚甲蓝标准品。取3 mL固相提取柱，置于固相提取装置上，取6 mL甲醇活化，加入6 mL标准品，提取亚甲蓝；用30%甲醇6 mL清洗，之后用含1%乙酸的甲醇溶液6 mL洗脱，于3500 rpm离心洗脱液10 min，取上清液作为标准品溶液。

1.3.2.3 样品制备：取3 mL固相提取柱，置于固相提取装置上，取6 mL甲醇活化，加入6 mL供试血浆，提取亚甲蓝；用30%甲醇6 mL清洗，之后用含1%乙酸的甲醇溶液2 mL洗脱（样本浓缩3倍），于3500 rpm离心洗脱液10 min，取上清液作为样品溶液。

1.3.2.4 测定和计算：用含1%乙酸的甲醇溶液做试剂空白，在653 nm处测定吸光度。根据规程中的计算公式计算测试样本亚甲蓝残留量。

1.4 统计学处理：实验结果用SPSS22.0统计学软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，数据比较用t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准品溯源性：见表1。

表1 两种试剂标准品溯源性

2.2 安全性：冰乙酸（分析纯）危险性类别属于酸性腐蚀品。见表2。

表2 两种试剂所用试剂

2.3 时限性：两种试剂检测每批次样本耗时：试剂盒检测每批次（10个样本）需要0.5 h，自配试剂检测每批次（10个样本）需要1 h。见表3。

表3 两种试剂检测每批次样本耗时

2.4 结果可比性：两种试剂平行检测病毒灭活血浆亚甲蓝残留量测定结果：亚甲蓝质控品检测结果均在控。两种试剂平行检测病毒灭活血浆亚甲蓝残留量测定结果差异性无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 两种试剂亚甲蓝残留量测定结果（μmol/L）

3 讨论

根据《献血者健康检查要求》（GB18467-2012）规定，献血后血液检测只局限于对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒（HIV）、梅毒（TP）进行病毒检测，不可能完全杜绝经输血传播的病毒感染风险[6]。亚甲蓝能与病原微生物核酸和蛋白结合，在适当波长的荧光照射下，发生一系列化学或光生物效应导致病原体失活达到灭活血液病毒的目的[7]。同时，一次性使用血浆病毒灭活器材能有效地去除血浆中残存的白细胞，提高病毒灭活的安全性，能有效地控制病毒灭活血浆的安全性[8]，尤其是对脂包膜病毒的灭活效果很理想[9]。研究证明，亚甲蓝光化学法能有效灭活血浆中多种脂质包膜病毒以及尚未列入检测的病毒[10-11]。亚甲蓝光照法中亚甲蓝的释放量是决定病毒灭活程度的关键参量，亚甲蓝释放量过高，血浆中残留量过大，易于导致累积毒性，而过低，又不能保证病毒灭活的效果。因此，需要对病毒灭活血浆中残留的亚甲蓝进行检测。亚甲蓝的检测方法有固相萃取-分光光度法、增敏荧光光谱法、高效液相色谱法、化学发光法、共振瑞利散射光谱法[12]。《血站技术操作规程》（2019版）采用固相萃取-分光光度法进行病毒灭活血浆亚甲蓝残留量的检测。但是在实际检测工作中，规程采用的亚甲蓝残留量检测项目的常规检测方法操作工费时[13]。采用自配试剂检测病毒灭活血浆亚甲蓝残留量，工作流程烦琐，每次配制时由于工作人员、试剂、操作等原因造成的批间误差也大[14]。血站质量管理部门检测结果直接反应血液内在质量和血站采供血过程控制情况，直接影响采供血过程的纠偏效果[15]。在血液抽检过程中严格按照标准操作规程确保检测结果的准确性，将血液的每一步环节把握到位，才能保障血液安全[16-17]。试剂盒生产标准化，按照GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》要求，试剂盒校准品溯源至企业工作校准品（由纯品采用称量法赋值）。而自制试剂中的亚甲蓝标准品，无相关标准，无法溯源。试剂盒中包含的R1：甲醇，R2：30%甲醇，R3：1%乙酸甲醇三种试剂，均为无毒无害试剂。而配制1%乙酸甲醇溶液所用到的冰乙酸（分析纯）危险性类别属于酸性腐蚀品，存在生物安全隐患。试剂盒生产标准化，试剂稳定性为6个月。自配试剂的标准品、30%甲醇、1%乙酸甲醇需要进行配置，而且配置后稳定性难以评估，往往需要在实验过程中现配先用，耗时，因而，在检测每批次样本时，试剂盒由于不需要进行试剂的配制，要比自配试剂节省0.5 h。

从本文测定结果来看，两种试剂平行检测病毒灭活血浆亚甲蓝残留量测定结果差异性无统计学意义（P＞0.05），表明试剂盒与《血站技术操作规程》（2019版）介绍的自配试剂在检测病毒灭活亚甲蓝残留量上结果一致，符合其要求。

综上，商品化试剂盒标准品可溯源、安全、省时、结果准确，可以用于病毒灭活血浆亚甲蓝残留量的检测。