间充质干细胞治疗心肌梗死的旁分泌途径修复机制的研究进展

杨亚冬，唐靓，杨耿，罗涛，徐怡朦，张文元

（浙江省医学科学院，浙江 杭州 310013）

间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，在特定条件下能被诱导向三个胚层分化[1]，且它具有易分离、易扩增培养的特点，成为再生医学领域研究者们感兴趣的热点细胞。在细胞疗法发展的近20年，间充质干细胞由于其自身的优点，是最有望首先上市的干细胞制剂之一，用于治疗目前临床上难以治愈的疾病。由于心肌细胞再生能力有限，心肌梗死 （Myocardial Infarction，MI）后死亡的心肌组织逐渐被无收缩功能的瘢痕组织替代，梗死区心脏承受异常应力，导致梗死区心壁变薄，心室腔扩大，发生左心室重构，最终导致心力衰竭甚至死亡[2]。目前临床上治疗MI不能从根本上修复受损的心肌组织，而通过干细胞移植重建功能性心肌替代瘢痕组织，将是有效恢复心功能的理想途径。大量临床实验数据显示，移植自体或同种异体的干细胞治疗心血管疾病是安全的[3]。MSCs治疗急性心肌梗死或充血性心力衰竭患者能提高心脏功能和减缓心脏重构。然而对于MSCs发挥修复作用的机制尚不清楚，存在各种争议，很多都处于假说阶段，如细胞转分化、旁分泌信号、免疫调节和直接的电生理耦合等[1，4]。本文针对目前研究较多的MSCs在心肌梗死治疗中通过旁分泌途径发挥修复机制进行综述。

1 旁分泌途径修复机制

在MSCs移植后，MSCs定植频度和在心脏内分化的量不足以解释其显著的修复效果，提示MSCs定植和分化非主要修复因素[1]。但是，众所周知MSCs能分泌可溶性旁分泌因子，由此推测其有助于内源性心肌再生和血管再生。

1.1 动员内源性心脏干细胞

哺乳动物体内有心脏干细胞池的说法已经得到公认，诸多研究者从心脏里分离出能分化成心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等心脏前体细胞，即心脏干细胞（Cardiac Stem Cells，CSCs）。 根据细胞表面抗原分为不同的亚群，如c-Kit+细胞、Sca-1+细胞、心脏球细胞和Isl1+细胞等[5]。在一般情况下，如果没有触发机制，心脏损伤刺激仅动员少量内源性心脏干细胞分化成心肌细胞和血管细胞，完全达不到损伤部位的修复。研究发现移植MSCs后，外源的MSCs归巢和定植到损伤部位的量非常少[6]，至于外源性MSCs能否通过转分化成心肌细胞和/或血管内皮细胞来修复损伤的心肌组织目前还存在争议，2006年Grinnemo等[7]将人类MSCs植入心脏缺血性动物模型中，未发现向心肌细胞分化。而Hou等[8]在2007年研究中将骨髓MSCs输注到心肌梗死大鼠体内，移植4周后免疫组化发现在移植的MSCs中表达肌间线蛋白，这是一种早期肌细胞的标记，但心肌细胞无显著的增殖，提示骨髓MSCs移植后有可能通过转分化成早期心肌细胞对梗死心肌组织进行修复。诸多研究证实，MSCs治疗心肌梗死对心脏功能改善的效果是肯定的，但是单独的内源性心脏干细胞或外源性MSCs均完成不了此项修复工作，所以推测在CSCs和外源的MSCs之间可能通过介质，产生了1+1＞2的效果。

移植后定植在损伤心肌的MSCs可能是触发内源性心脏干细胞激活的关键，移植的MSCs通过释放旁分泌因子，如血管内皮生长因子（VEGF），肝细胞生长因子（HGF），胰岛素样生长因子1（IGF-1）等，使心脏干细胞及心脏干细胞池内的其他干细胞分化修复梗死区死亡心肌组织。心脏干细胞具有IGF-1受体系统，能自主生成纳米纤维肽 （NFIGF-1），产生缓释效果，逐渐释放至心肌组织。2009年Padin-Iruegas等[9]研究将 NF-IGF-1与心脏祖细胞联合输注和分别单独输注治疗心肌梗死大鼠，各组均检测到新的心肌细胞，联合治疗组形成的心肌细胞数量最多。由此推测可能是输注的心脏祖细胞释放多种肽，联合NF-IGF-1导致内源性心脏祖细胞被募集到梗死区，分化成心肌结构，来修复损伤心肌，改善心功能。这种旁分泌效应可能是激活IP3K/Akt效应通路后介导的。2010年Gao等[10]研究证实骨髓MSCs移植后，apelin多肽这种内源性配体的表达水平显著提高，推测可能是MSCs分化成心肌细胞的过程中激活了apelin-APJ途径，启动了内源性干细胞修复心肌过程，使心功能得以恢复。那么apelin多肽是如何促进心脏修复的？Zhang等[11]在2016年向心肌梗死SD大鼠心内注射apelin13，对照组注射生理盐水，apelin13治疗组在注射28天后出现Ki-67+-c-kit+/Sca-1+/Flk-1+内源性心脏干细胞或祖细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western-blot检测也从转录和翻译水平证实 c-kit+，Sca-1+和 Flk-1+显著增加，这些结果表明apelin13能加强心脏的内源性心肌干细胞动员、存活和增殖，提示MSCs移植治疗能通过旁分泌途径动员内源性心脏干细胞对梗死心肌进行修复。Wang等[12]综合大量研究认为从移植的细胞释放的旁分泌信号十分重要，它能保护受损的心肌细胞，并可激活内源性心脏祖细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞。因此，为了动员内源性心脏干细胞促进心肌梗死区组织修复，可以利用已证实的有效细胞因子直接注射在心肌梗死区域进行治疗，强化旁分泌修复机制。

1.2 诱导血管生成 心肌梗死后局部形成了缺血缺氧环境，梗死区心肌细胞缺血坏死，难以自行修复。有研究报道，将具有多分化潜能的MSCs通过冠脉注射、心肌内注射或尾静脉注射等多种方式移植入体内，因MSCs具有向受损组织归巢的能力，但其归巢机制极其复杂，目前比较认同的是基质细胞衍生因子-1/趋化因子受体-4（SDF-1/CXCR-4）通路在起重要作用[13]。研究证实，SDF-1能帮助干细胞穿过血管壁迁移并定植在梗死区，发挥旁分泌效应，促进血管新生并保护存活心肌等。2009年徐亚丽等[14]通过免疫组化法和Western-blot检测梗死区SDF-1的表达和血管内皮生长因子 （VEFG）蛋白定量分析，发现MSCs移植后SDF-1表达高于对照组，证实MSCs通过旁分泌机制促进SDF-1产生，从而对MSCs的归巢和黏附产生了正反馈作用。实验组高表达VEGF蛋白，表明移植的MSCs通过旁分泌途径促使VEGF在心肌梗死区的分泌，促进血管新生和改善心肌缺血。近期有报道，通过外泌体预处理或修饰细胞的方式来研究细胞治疗的效果。2016年Zhang等[15]研究中利用源自MSCs的外泌体预处理心脏干细胞，治疗心肌梗死大鼠模型，结果发现显著提高了心脏干细胞的存活率，增加了毛细血管的密度，减少了心脏纤维化，使心脏功能恢复。这个研究设计就是对MSCs旁分泌效应的应用，从而证实MSCs能通过旁分泌方式分泌多种细胞因子和趋化因子，对损伤组织进行修复。Ma等[16]2017年研究蛋白激酶 （Akt）修饰的人脐带血间充质干细胞源的外泌体（Akt-Exo）通过尾静脉注射治疗大鼠急性心肌梗死模型，显著加速内皮细胞增殖、迁移和血管形成。通过激活血小板源性生长因子D改善心脏重构和促进血管生成。2017年Dong等[17]通过注射来自过表达钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶-1（CAMKK1）的MSCs的条件培养基来治疗急性心肌梗死，观察其血管密度和瘢痕形成的变化来量化修复效果，发现注射这种条件培养基后会导致血管密度增加，减少瘢痕形成，并提高心脏功能。CAMKK1是一种转移酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，它的一个主要功能是调节细胞过程中钙触发信号，提示CAMKK1可作为调节MSCs分泌蛋白用于心肌梗死的治疗。目前有较多通过基因转染的方式，加强MSCs治疗心肌梗死后血管新生的研究，在这些有前景的基因或因子用于临床前，还需很多的研究来论证。

2 MSCs其它效应

移植的MSCs在心肌梗死微环境下分泌大量的生物活性因子，不仅能诱导其分化成心肌细胞，促进血管新生，还具有抗炎，调节机体免疫、抗凋亡、减轻心肌细胞纤维化，抑制心肌重构等作用，以辅助修复受损的心肌组织，并改善心脏功能。

2.1 抗炎效应 心肌梗死后会发生一系列的炎症反应，心肌组织中出现许多炎性细胞因子，尤其是IL-1β、IL-6、TNF-α等被证实是参与心肌梗死心室重构的重要炎性因子。许多体内外研究显示MSCs能对多种免疫细胞的功能进行调节，并调节相关的炎性细胞因子。朱玲军等[18]研究发现MSCs移植能使炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达水平明显下调，改善心肌梗死大鼠的心功能，尤其激活Notch信号的MSCs移植效果更佳，这是由于Notch信号可调控MSCs增殖分化，平衡抗炎与促炎细胞因子表达，从而调节心肌梗死后各种免疫反应，达到心功能的改善。研究证实IL-10能通过抑制炎症治疗心肌梗死，2018年Meng等[19]利用腺病毒转染IL-10至骨髓MSCs，并移植于心肌梗死动物模型，与单独移植MSCs或IL-10组比较，能更显著降低机体系统的和局部的炎症反应，使模型动物的心肌梗死面积更小，心脏损伤和细胞凋亡发生率更低，提示可以通过IL-10和MSCs或更多的治疗因子协同抗炎治疗心脏损伤。

2.2 抗凋亡效应 MSCs移植改善梗死后心脏功能的机制，可能与其分泌多种因子抗心肌细胞凋亡有关[20]。为证实这个作用，王曼等[21]利用抗凋亡基因Bcl-2修饰骨髓来源MSCs，通过检测Bcl-2mRNA表达量证实抗心肌细胞凋亡的作用，结果发现Bcl-2修饰的MSCs移植组梗死边缘区心肌组织Bcl-2mRNA表达为 1.015±0.115，未修饰组为0.358±0.057，而移植培养基的空白对照组仅为0.090±0.065，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且通过各项心功能检测实验组比空白对照组心肌梗死后心功能明显改善，抑制了心室重构，从这结果发现，经抑制凋亡基因修饰后的MSCs抗凋亡效果更明显，未修饰的MSCs移植后抗凋亡效果虽然比Bcl-2修饰地差，但是与空白对照组比效果也是有显著差异的。表明MSCs移植后可通过旁分泌途径发挥抗凋亡作用，改善心功能，因此可以利用基因修饰细胞达到增强抗凋亡作用。研究人员还发现通过操控microRNA来调节MSCs移植治疗心肌梗死。miR-133a在心肌中大量表达，心肌梗死后表达量就下降。Dakhlallah等[22]采用miRNA模拟物对MSCs进行重编程来观察是否能增加干细胞在损伤心肌中的存活。将miR-133a模拟物转染MSCs后移植治疗心肌梗死大鼠，发现能显著增加移植细胞在梗死区域的定植，改善心脏功能，减少纤维化。经分子水平检测发现，促凋亡因子Apaf1、caspase-9和caspase-3表达减少，miR-133a是A-paf1的直接作用靶点。所以，可知miR-133a转染MSCs后增强其抗凋亡的作用，使移植细胞在梗死区定植量增加，使更多的MSCs通过各种修复途径促进对心脏的修复。Mao等[23]研究发现，miR-23a通过调节凋亡因子caspase-7参与肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导骨髓MSC凋亡，给心肌梗死大鼠模型输注过表达 miR-23a的骨髓MSCs能改善左心室功能，减少梗死面积。但是，还需要更多的研究来不断完善这些抗凋亡因子的调节途径和方式，为进一步应用于组织损伤修复带来更广泛的选择。

2.3 改善心脏重构 心肌梗死后心室重构是治疗难点，研究者们一直在探索有效的方法来逆转心室重构，改善心肌梗死患者的近期及远期预后。心肌营养素-1（CT-1）是一种致心肌肥厚的因子，心肌梗死后CT-1基因会出现大量的表达。李恩等[24]将骨髓MSCs通过尾静脉移植到心肌梗死大鼠体内，测定各组非梗死区心肌CT-1 mRNA及其蛋白含量，发现比仅移植培养基的心肌梗死对照组明显下降，但较假手术组则明显升高，提示骨髓MSCs能抑制大鼠心肌梗死后CT-1 mRNA及蛋白表达，从而改善心肌重构。MSCs对心室重构的治疗是通过多种因素来实现的，如Chen等[25]研究将脂肪来源的MSCs种植在富血小板纤维蛋白（RPF）上，并黏附在SD大鼠心肌梗死区，结果发现移植MSCs+RPF组比仅移植RPF组左心室壁更厚、梗死面积更小，纤维化面积更少。通过检测各种因子发现抗炎因子如IL-10，抗凋亡因子如Bcl-2，抗纤维化因子如Smad1/5、BMP-2，血管生成因子如SDF-1、CXCR4、VEGF等都参与了此过程，所以心室重构是个复杂的过程，实验中植入脂肪来源MSCs比空白支架移植效果好，提示脂肪来源的MSCs能保护左心室功能，改善心室重构。Mao等[36]研究发现整合素连接激酶（ILK）促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，ILK修饰MSCs后移植治疗能改善心肌梗死后的心室重构和心脏功能，与MSCs促进血管新生、减少细胞凋亡和增加心肌细胞增殖有关。

3 展望

心脏细胞疗法被认为是一种有望治疗心脏疾病的新途径，但仍有许多不尽人意的方面。再生医学领域初始的狂热退去后，大量的实验证实心脏细胞疗法在提高心脏功能的疗效上作用是有限的，并且缺少足够研究结果来证实该疗法长期的良好预后[27]。虽然已经有大量的研究证实MSCs分泌蛋白的优点，但对于调节MSCs分泌蛋白质组的分子机制知之甚少。MSCs能分泌大量的旁分泌因子，可是在心脏修复发挥旁分泌的效果可能取决于集群而不是单一的因素，对发挥主要作用的因素仍然未知。所以，目前基于MSCs治疗心肌梗死只是被作为一种辅助手段，相信随着医学研究的深入有望治疗心肌梗死。

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