傣药芽三英接骨膏提取工艺研究

刘承清 赵应红 李晓幸

摘要：目的 优选傣药芽三英接骨膏制剂提取工艺条件。方法 采用高效液相色谱法测定煎煮液中槲皮素的含量，以浸膏得率、槲皮素含量为考察指标，以加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，采用正交试验对处方中六味需要水提取的傣药材进行提取工艺条件优选。结果 优选的提取工艺条件为12倍加水量，煎煮时间为60 min，煎煮2次。结论 优选的提取工艺合理可行，为傣药芽三英接骨膏煎煮的最佳提取工艺。

关键词：傣药；芽三英接骨膏；浸膏得率；槲皮素；正交试验

中图分类号：R931.7 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）10-0067-03

骨损伤是一种常见多发病；在临床上除骨骼损伤外，常伴有红肿、瘀血、隐隐作痛等症状，疗程长、痊愈慢。傣药芽三英接骨膏是根据云南省西双版纳傣族自治州名老傣医岩拉所献四代家传外用接骨秘方中筛选研制新的傣药制剂；也是西双版纳州傣医医院常用处方，具有促进骨痂生长、瘀斑消褪、活血化瘀、消炎止痛、续筋接骨的功效，用于治疗跌打损伤、骨折、风湿骨痛的传统制剂[1]。芽三英接骨膏由鱼子兰、血满草、黑皮跌打、三台红花、当归藤、羽萼叶、毛叶三条筋等药材组成，临床使用多年，对皮肤无刺激、无过敏性，并且使用方便、疗程短、价廉，其疗效和安全性已被证实[2]。原剂型是用傣药材细粉与开水调和而成的膏剂；不利于储存，使用时需要用绷带固定，不方便使用且容易污染。为了增加其稳定性，便于储存，提高有效成分提取率和经济效益，现对该制剂的提取工艺条件进行优选。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；UV-2401紫外-可见分光光度计（日本岛津）；TG328A电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KDM型调温电热套（山东省鄄城振兴仪器厂）；TA-816型光波炉（中山市天倚电器有限公司）；电热恒温鼓风干燥机（精宏XMTD-8222）；三用恒温水浴箱（精宏DK-600S）等。

1.2 试药 槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定，HPLC含量测定按99.1%计，批号：100081-201610）；娃哈哈纯净水；甲醇、磷酸为色谱纯，盐酸为分析纯；傣药材鱼子兰（批号：20160513）、血满草（批号：20170303）、黑皮跌打（批号：20160524）、三台红花（批号：20160708）、当归藤（批号：20160704）、栘树皮（批号：20161019）毛叶三条筋（批号：20160707）、羽萼叶（批号：20150331）、莪术（批号：150901）由西双版纳州版纳药业所提供。

2 方法与结果

2.1 药材吸水性试验 按处方比例称取鱼子兰、血满草、黑皮跌打、三台红花、当归藤等傣药材共计140 g，称取3份，分别加水浸泡，待傣药材浸润至透心，再称定润透后傣药材重量，计算傣药材吸水率为128%，吸水率=（润透傣药材量-傣药材量）/傣药材量[3-4]，试验安排见表1、表2。

2.2 正交试验设计 设定提取工艺参数：加水量（8倍、10倍、12倍），煎煮时间（60 min、90 min、120 min），煎煮次数（1次、2次、3次）；选择采用L9（34）正交设计表安排试验，因素水平安排表详见表3。

2.3 槲皮素含量测定[5]

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸（49：51）；柱温：35℃；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：370 nm[6]；进样量：10μL。理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于4000[7]。

2.3.2 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品在105℃干燥2 h后精密称定槲皮素对照品4.4 mg，置100 mL容量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液（每1 mL含槲皮素 0.044 mg）。

2.3.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取鱼子兰、血满草、黑皮跌打、三台红花、当归藤等傣药材，依法提取，提取液进行浓缩，之后放置于蒸发皿中水浴蒸干，干燥后冷却，精密称取适量干膏粉末置于150 mL圆底烧瓶内，精密加入80%甲醇50 mL，称重，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液20 mL，转移至50 mL容量瓶中，精密加入25%盐酸溶液7 mL，置85℃水浴中水解30 min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[5]。

2.3.4 阴性对照品溶液的制备 按处方比例称取缺血满草、栘树皮和三台红花的阴性对照药材（即鱼子兰、当归藤、黑皮跌打），按“2.3.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液，见图1。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 线性关系考察 分别精密量取上述槲皮素对照品溶液1mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，于10 mL容量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别精密吸取各溶液10 μL，注入液相色譜仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，槲皮素进样量为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=490 06X-54.918，r=0.9997（n=6），结果表明槲皮素对照品溶液进样量在4.4～44 μg范畴内与峰面积呈良好线性关系[5]。

2.3.4.2 精密度考察 精密吸取“2.3.2”项下制备的槲皮素对照品溶液10μL，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次。根据峰面积积分值计算RSD为0.08%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.4.3 稳定性考察 精密量取“2.3.3”项下制备的供试品溶液10μL，按“2.3.1”项下的方法分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积积分值计算RSD值为1.49%，结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.4.4 重复性考察 取同一方法提取的干燥粉末6份，按“2.3.3”项下方法，分别平行制备6份样品溶液，精密吸取10 μL，按“2.3.1”项下的方法测定峰面积。根据峰面积积分值计算供试品中槲皮素的含量，槲皮素含量平均值为1.7163 mg/g，SD值为0.0055，RSD值为0.303%，结果表明供试品溶液制备方法重复性良好。

2.3.4.5 加样回收率试验[8] 取已知含量（1.7181 mg/g）的样品6份，每份0.3 g，精密称定；精密称取槲皮素对照品0.00713 g置于25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，浓度为0.2852 mg/mL，分别精密吸取2 mL加入6个样品内，置圆底烧瓶内，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，加热回流90 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液20 mL，转移至50 mL容量瓶中，精密加入25%盐酸溶液7 mL，置85℃水浴中水解30 min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。精密吸取10 μL，按“2.3.1”项下的方法测定峰面积，计算槲皮素含量和回收率。槲皮素的平均回收率为100.15%，RSD为0.94%，结果见表4。

2.4 浸膏得率的测定方法 按处方比例称取鱼子兰、血满草、黑皮跌打、三台红花、当归藤等傣药材，共9份，按表2、表3所设计因素水平表依法进行提取，将煎煮液进行浓缩，将浓缩液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，在105℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min后迅速称定重量，计算浸膏得率（浸膏得率=浸膏量/生药投入量），结果见表5。

3.5 正交试验结果 采用L9（34）正交表进行试验，按照处方比例称取鱼子兰、血满草、黑皮跌打、三台红花、当归藤等傣药材，共9份，按表3所设计因素水平表依法进行提取，测定浸膏得率、槲皮素含量。正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

多指标综合评分时以各指标最大值为参照，对数据进行归一化，给出权重，干膏量和槲皮素含量权重系数均为0.5。即综合评分=（0.5×浸膏得率测定值/浸膏得率最大值+0.5×槲皮素含量测定值/槲皮素含量最大值）×100[9]。

由表5、表6可知，因素A（加水量）、因素B（煎煮次数）因素C（煎煮时间）对芽三英接骨膏提取均无显著性影响。由极差R得出影响因素大小顺序为C>A>B。此次试验中指标干膏量和槲皮素含量都是越高越好，通过直观分析（表5），选择各个因素K1、K2、K3中最大者所对应的水平，即A3B1C2，故确定A3B1C2为最佳提取条件，即加12倍量的水，提取2次，每次提取60 min。

4 工艺验证

在所选提取工艺条件下，将处方量放大5倍，平行3份，按照所选的最佳提取工艺条件为A3B1C2，即加12倍量的水，煎煮2次，每次煎煮60 min；按“3.4”项下方法测定浸膏得率；按“3.3.3”项下方法，制备样品溶液，按“3.3.1”项下的方法测定峰面积，用0.22μm微孔滤膜滤过，进样量10μL，每份进样2针，测定槲皮素的峰面积，计算含量，结果见表7。

按照优选出的提取工艺条件为A3B1C2进行三次平行操作，浸膏得率平均值高于正交试验中的最高值，槲皮素含量平均值接近正交试验中的最高值，说明优选的提取工艺得率高，合理可行，因此作为最佳提取工艺条件。

5 讨论

色谱条件优化时，选择甲醇为有机相，基线较平，干扰较小；选择磷酸作为流动相水相，结果显示磷酸可以显著提高分离效果，磷酸过多的加入会明显增高基线。最终选择甲醇-0.5%磷酸（49：51）为流动相，所检测的槲皮素色谱峰到达基线分离，峰形较好，分离度较高[10]。本文采用HPLC法测定槲皮素含量，进行方法学考察，结果表明该测定方法简便，测定结果准确，重复性好，稳定性高。

目前，傣药膏剂提取工艺研究较少，主要提取工艺研究多采用加水量、提取时间、提取次数作为工艺考察因素。鉴于傣药复方成分的复杂性，任何单一成分均难以代表制剂的效应，因此本文采用浸膏得率和槲皮素两个指标，设计L9（34）正交试验考察傣药接骨膏的提取工艺，运用某种单一指标进行提取工艺控制更为科学合理。在提取工艺条件中，由于各指标的因素互不相同，因此原始样本数据中各变量的数量级存在很大差别。为了便于综合评分时比较分析，在研究过程中对各指标数据进行必要的标准化处理。标准化处理的方法很多，本文采用的是Ci/Ci（max），即数据除以该组最大数使数量级统一[11]。采用多指标信息熵权重分析法，结合正交设计优化制备工艺，既保证了评价指标的全面性，又可根据各指标不同的影响程度进行权重系数的分配，使提取工艺路线的优化更为合理、可信，结果分析更为科学、客观。根据正交试验结果，影响此次试验提取结果的关键因素依次是煎煮次数、加水量、煎煮时间，再结合综合评分、经济效益的角度考虑，以浸膏得率和槲皮素含量高为佳，优选的提取条件为A3B1C2，即用12倍量水，煎煮2次，每次煎煮60 min。

对膏剂的研究，必须重视安全、科学、实用原则。本文优选的提取工艺条件简练、稳定，可作为傣药芽三英接骨膏的提取工艺条件。本试验作为规范芽三英接骨膏制备工艺的有益尝试，为保障芽三英接骨膏质量以更好地服务于医疗保健提供依据。

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（收稿日期：2018-07-09）