细胞内的氧化还原感受器蛋白与氧化还原信号转导*

魏亚萍， 王 媛， 郭晓笋△， 蒋 凡,3△

(山东大学 1基础医学院生理与病理生理学系， 2齐鲁医院急诊科， 3教育部和国家卫计委心血管重构和功能研究重点实验室， 山东 济南 250012)

1 背景

氧化还原反应是哺乳动物细胞存活所必需的，在细胞内的生化反应及代谢过程中氧化与还原占据着重要的位置。细胞内环境中氧化还原状态的轻微改变可能对细胞的生物活性产生重大影响。理论上，细胞内氧化还原状态的改变必须通过测定不同氧化还原电子对的还原电位来定量[1-2]。但在实际的生物学研究当中，人们所说的氧化还原状态通常是指胞内或细胞周边活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的相对高低。活性氧的大量产生可能对细胞造成氧化损伤，即我们通常所说的“氧化应激(oxidative stress)”状态。目前大量研究显示，氧化应激与心血管系统疾病、神经退行性疾病、糖脂代谢疾病，以及衰老的过程密切相关。但是值得我们关注的是，在研究疾病发生机制的过程中，我们不应该简单地把ROS产生增加等同于氧化应激损伤。实际上，细胞内存在多种对氧化还原状态敏感的蛋白，氧化还原状态的改变可以影响这些蛋白的功能，并对其下游的信号通路产生调控作用。因此我们可以认为这些蛋白分子是细胞内氧化还原状态的感受器(redox sensor)。这些氧化还原感受器能够被ROS激活，而且在很多情况下这些氧化还原敏感的信号蛋白能够介导细胞的保护作用，提高细胞的应激耐受水平。因此，深入挖掘ROS产生背后是否还隐藏有更复杂、更具特异性的信号转导通路，可能为发现疾病发生发展过程中新的调控机制提供线索。

我们考察一个蛋白分子是否有氧化还原感受器的功能时，首先需要区分这个蛋白是否能够直接对氧化还原起反应，即其功能是能够被蛋白本身氧化还原修饰所调控，还是其活性的改变是否通过其它传感器分子间接为ROS所影响。其次，我们还需要区分这个蛋白分子能否对细胞内源性产生的ROS分子(如细胞内NADPH氧化酶或线粒体产生的ROS)产生应答，还是仅仅能够被大量外源性的ROS(即严重的氧化应激状态)非特异性地损伤或灭活。大约30年前，研究者发现哺乳动物细胞可以自主产生ROS，并借助这些ROS分子调控细胞功能[3]。在此之后，人们观察到在原核细胞中，有些转录因子可通过直接感知ROS分子(如超氧阴离子及过氧化氢)的存在来调节其与DNA的结合活性，从而调控某些基因的表达[4]，这些基因的产物通常是具有抗氧化保护作用的分子。之后，人们进一步发现在哺乳动物细胞中也存在类似现象[5]。基于此，人们提出了“氧化还原信号转导(redox signaling transduction)”的概念，即细胞可以借助ROS[包括一氧化氮(nitric oxide,NO)分子]进行细胞内或细胞间的信息传递[6]。

2 氧化还原敏感的转录因子

目前已知的蛋白分子氧化还原感知能力的主要分子机制是通过ROS(氧化)或NO(S-亚硝基化)所介导的巯基基团(主要是半胱氨酸残基)的氧化还原修饰而实现的[7-8],见图1。激活蛋白 1(activator protein 1，AP-1)是由c-Fos和c-Jun蛋白组成的异源二聚体，它作为一种典型的具有氧化还原感知功能的转录因子，是人们最早发现的氧化还原感受器之一[9]。在Fos与Jun的DNA结合区域均含有高度保守的半胱氨酸，对氧化还原调控显现敏感性[5];该半胱氨酸的氧化可抑制AP-1的DNA结合活性，巯基抗氧化剂可逆转这种作用。之后有研究证实，哺乳动物表达的热休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)可直接感知氧化还原变化。过氧化氢可刺激HSF1组装成同源三聚体，其组装依赖于HSF1 DNA结合结构域的2个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸参与对氧化还原反应敏感的二硫键的形成[10]。HSF1突变体(1个或2个半胱氨酸被替换)不能形成ROS诱导的三聚体，其DNA结合功能受损。最近的一项研究表明，Ets家族的转录因子(如Etv1、Etv4和Etv5)可通过二硫键形成同源二聚体，与单体相比，Ets二聚体的DNA结合能力显著降低，表明氧化还原依赖的调控机制可能会影响这些Ets转录因子的活性[11]。Etv蛋白与肿瘤发生密切相关，因此氧化还原依赖的二聚体形成可能参与Etv蛋白介导的肿瘤细胞对微环境的应答反应。以上实例提示ROS(特别是过氧化氢)介导的分子内或分子间半胱氨酸巯基氧化可以直接调控多种转录因子的活性，这一机制可以解释很多对氧化还原敏感的细胞学效应。值得注意的是，研究发现，越来越多的转录因子具有氧化还原感受器的功能，提示这可能是细胞内一个非常重要的转录调控机制。

Figure 1. Different types of redox modification of cysteine (Cys). A: oxidative modifications. The initial cysteine oxidation reaction is reversible. However, when oxidative stress persists, the oxidation reactions become irreversible. B:S-nitrosylation. C:S-glutathionylation. Trx: thioredoxin; Grx: glutaredoxin; GSNOR:S-nitrosoglutathione reductase; GSH: glutathione.

图1不同形式的半胱氨酸氧化还原修饰

3 氧化还原敏感的核受体

Rev-erbβ是一种新发现的能感知氧化还原状态的转录因子，其本身是能与血红素结合的核激素受体[12]。Rev-erbβ分子中的巯基二硫键氧化还原开关可调控其配体结合结构域与血红素的相互作用，其中还原型Rev-erbβ的结合能力是氧化型的5倍。此外，Okamoto等[13]报道肌肉特异性转录因子——肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)会发生NO诱导的亚硝基化作用，破坏MEF2与DNA结合及其转录活性，具体过程为：MEF2形成二聚体后形成一个分子口袋结构，可促进DNA结合结构域中保守半胱氨酸的S-亚硝基化。这种氧化还原改变可抑制神经发生和神经元存活，可能是NO参与神经退行性疾病的一个重要分子机制[13]。

4 氧化还原敏感的转录辅助调节因子

细胞中有多种转录因子还可以通过与氧化还原敏感的调控因子结合来间接感知氧化还原变化，这一机制在氧化还原依赖的转录调控方面也发挥重要作用。例如，氧化还原敏感的多功能蛋白APE1/Ref-1是多个转录因子的调控因子，包括AP-1、核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)、p53、激活转录因子/cAMP反应元件结合蛋白(activating transcription factor/cyclic AMP response element binding protein，ATF/CREB)及低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α)等[14]。通常情况下，ROS引起的氧化反应可以使这些转录因子的DNA结合活性降低，而Ref-1可以使这些转录因子还原，并提高其转录活性[14]。但是，Ref-1的效应似乎不具特异性，因此很难将这些作用归结为一条特异的信号传导通路。

在通过氧化还原敏感的辅助因子特异性地调节转录因子的功能中，最具代表性的例子可能是Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)系统[15]。Keap1为富含半胱氨酸的蛋白质，其分子中的3个半胱氨酸(第151、273和288位)在氧化还原依赖的Keap1构象改变中发挥重要作用[14, 16]。Keap1与Nrf2结合可促进Nrf2蛋白泛素化及快速降解；而Keap1经氧化后与Nrf2解离，使得Nrf2在核内累积，促进多种具有抗氧化和细胞保护功能的酶类表达[16]。Keap1能对外源性氧化应激产生应答，同时对NADPH氧化酶产生的细胞内源性ROS也能产生应答[17]。

另一项研究表明，信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)亦可被氧化还原所调控，其调控机制与过氧化物氧还蛋白2(peroxiredoxin-2)有关[18]。Peroxiredoxin是细胞内广泛存在的、能与过氧化氢起反应的抗氧化活性蛋白。在过氧化氢作用下，peroxiredoxin-2可与STAT3形成二硫化中间体，进而催化STAT3分子间二硫键形成，形成STAT3寡聚体，降低STAT3的转录活性。STAT3的氧化是可逆的，可被细胞内的硫氧还蛋白(thioredoxin)还原[18]。

5 氧化还原敏感的酪氨酸激酶及酪氨酸磷酸酶

Smith等[19]证实,基于半胱氨酸的氧化还原“开关”还存在于非受体酪氨酸激酶Janus kinase 2 (JAK2)中，并可调节JAK2的催化活性。JAK2为转录因子STAT的上游激酶，该通路参与调控细胞增殖、存活及髓系造血功能。研究表明，JAK2的2个半胱氨酸(866与917)可共同发挥氧化还原敏感的“开关”作用，使得JAK2的催化活性直接受细胞氧化还原状态的调控。将JAK2中这2个半胱氨酸突变为丙氨酸后，则JAK2对氧化还原不再敏感[19]。

目前研究最为深入的氧化还原敏感的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)是PTP1B。位于PTP1B活性结构域第215位的半胱氨酸残基(Cys215)是其催化活性所必需的，其它PTPs家族成员也由相似的半胱氨酸残基决定其活性[20]。PTP1B依靠巯基阴离子基团对底物进行亲核反应，但巯基阴离子对氧化作用十分敏感，例如半胱氨酸残基可被胞内产生的过氧化氢氧化。自由巯基被氧化形成次磺酸，继而与相邻的Ser216残基反应形成磺胺，因此细胞中的ROS可以使PTP1B失活[20]。PTP1B的底物非常多样，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor)、集落刺激因子1受体(colony-stimulating factor 1 receptor)、c-Src以及黏着斑激酶(focal adhesion kinase)等等[21]，因此可以预测ROS能够通过调节PTP1B的活性影响多种细胞功能。

6 丝/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶

共济失调毛细血管扩张症突变型(the ataxia-telangiectasia mutated，ATM) 激酶是细胞DNA损伤反应通路中一个重要的丝/苏氨酸蛋白激酶。传统的ATM激酶激活时可刺激DNA的双链损伤。然而最近的研究发现，ROS对ATM激酶有直接激活作用，且这种作用不依赖于DNA损伤及ATM上游的激活物MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) 复合体[22]。H2O2可以直接氧化ATM激酶，进而形成具有功能活性的二聚体。在ATM激酶氧化-活化过程中，位于ATM激酶分子C端的第2 991位半胱氨酸具有决定性作用。将C2991突变为亮氨酸后，ATM激酶失去对H2O2的反应性，而对DNA损伤和MRN 复合体的反应性不受影响[22]。目前有证据显示ATM激酶的氧化还原调控可能在代谢性疾病中发挥重要作用。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族在控制细胞增殖、迁移、存活、分化及炎症反应等诸多生物功能方面占据重要的中心位置。MAPK的功能受MAPK磷酸酶(MAPK phosphatase，MKP)的负向调控。其中MKP-1是一个具有酪氨酸/丝苏氨酸磷酸酶双重活性的酶，能够拮抗p38和ERK1/2的功能。与酪氨酸磷酸酶类似，MKP的活性中心也存在关键的半胱氨酸残基。Kim等[23]的研究发现，MKP-1分子中第258位半胱氨酸可以在有ROS或NO，以及谷胱甘肽存在的情况下，发生S-谷胱甘肽化(S-glutathionylation),见图1C，即蛋白质的反应性巯基与氧化的谷胱甘肽之间形成二硫键。MKP-1的S-谷胱甘肽化抑制了其磷酸酶活性，并促进MKP-1经蛋白酶体途径的降解。该研究还证实细胞内源性NOX4型NADPH氧化酶所产生的 H2O2能够通过这个途径调控MKP-1的功能及细胞的炎症反应[23]

7 氧化还原敏感的离子通道

越来越多的研究结果显示，细胞中多种离子通道蛋白具有氧化还原感受器的功能[24]。例如，钙库操纵性钙内流通道的主要组成成分之一——基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)[25]就具有直接的氧化还原感受功能，这种功能依赖于其内质网腔面的一个半胱氨酸C56。在氧化应激情况下，C56发生S-谷胱甘肽化，并显示出钙库非依赖性的钙通道活性增强[26]。同时，钙库操纵性钙通道的另一个主要组成部分Orai1蛋白[25]也具有氧化还原敏感性。Orai1分子中的活性半胱氨酸 C195 能够对H2O2发生反应并抑制Orai1介导的钙内流[26]。从以上结果可以看出，目前对氧化还原状态如何精确调控钙库操纵性钙内流还没有形成统一认识。 另外一个氧化还原敏感的离子通道的实例是腺苷受体P2X。P2X受体是非选择性的阳离子门控通道。研究发现P2X2受体的功能受ROS调控，其分子中的第430位半胱氨酸氧化后会导致P2X2受体的功能上调[27]。然而目前的证据也提示不同亚型的P2X受体对ROS的反应性(功能上调或下调)可能存在明显差异[27]。 除钙库操纵性钙通道和P2X受体外，其它类型离子通道的某些成员，包括线粒体钙单向转运体(mitochondrial Ca2+uniporter)、瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels)、电压门控钙通道(voltage-gated Ca2+channels)、电压门控钾通道(voltage-gated K+channels)以及ryanodine receptor钙通道等，均被证实具有氧化还原感知功能。目前所有这些研究结果提示，氧化还原引起的半胱氨酸修饰可能是ROS调控这些离子通道共同的分子机制[24]。

8 氧化还原调节细胞骨架蛋白

除了以上提到的这些信号分子能够感受细胞内氧化还原状态的改变，并介导相应的氧化还原信号转导功能外，越来越多的研究还发现，细胞内的结构蛋白和骨架蛋白亦有氧化还原感受器的功能。例如，人们发现在肌动蛋白(actin)、肌动蛋白结合蛋白及肌动蛋白调节蛋白的分子中均含有氧化还原反应性的半胱氨酸残基以及蛋氨酸残基位点。ROS能够通过改变这些位点的氧化还原状态调节细胞骨架的结构功能，进而对细胞的迁移、增殖及形态变化产生重要影响[28]。目前已知α-肌动蛋白中的5个半胱氨酸残基及β-肌动蛋白中的6个半胱氨酸残基都可以发生氧化，而新近研究显示，生理条件下较低浓度的ROS可以促进肌动蛋白的聚合以及细胞内张力纤维的形成[28]。除细胞骨架蛋白外，人们还发现某些结构蛋白也显现氧化还原敏感性。闭合蛋白(occludin)是细胞间形成紧密连接重要的结构蛋白。Walter等[29]的研究显示，occludin蛋白胞内C末端的第408位半胱氨酸在介导occludin二聚体形成过程中具有决定作用，而该半胱氨酸残基是受氧化还原调控的。

9 结束语

综上所述，目前人们已经发现哺乳动物细胞内存在多种具有氧化还原感知功能的蛋白，包括转录因子、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道以及细胞结构蛋白等。目前，我们还不清楚为何细胞内含有如此多的氧化还原感受器。为此，我们提出两种假说。第一，这种现象可能反映了氧化应激损伤对哺乳动物细胞影响的重要性，为了克服氧化应激的损伤作用，细胞需要一个信号网络，而不是单一独立的信号通路，及时对ROS作出反应以维持细胞内稳态；第二，从进化的角度来说，氧化还原信号转导机制可能已演变为一种通用的细胞内警报系统[30-31]。我们回顾文献发现，自然界中为数众多的、相互没有关联的应激刺激都能使细胞内ROS产生增加，进而通过氧化还原机制调控细胞内信号传导过程。此时ROS分子可以被认为起动了一种类似预适应(preconditioning)过程的反应，氧化还原信号转导通路可以将初始的刺激信号进行整合放大，提高细胞对应激的耐受性，因而对后续的应激刺激产生抗性[30-31]。如果刺激过强，ROS产生过多，则氧化还原信号转导通路可触发细胞的凋亡过程。我们预测还有很多的氧化还原传感器样的蛋白分子尚未被发现，而我们对细胞内氧化还原信号转导网络的整体认识尚很不全面。目前现有的证据充分说明我们不能把细胞内ROS产生增加简单地等同于氧化应激损伤，而忽略其背后是否还有更复杂的生物学机制。

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