运动训练激活中枢ACE2-Ang(1-7)-MAS轴延缓高血压进展*

赵晓霖， 彭雯雯， 刘国英， 洪 玲， 李明余， 潘燕霞

(福建医科大学医学技术与工程学院康复治疗学系， 福建 福州 350004)

高血压前期(prehypertension)是指血压处于120～139/80～90 mmHg的特定阶段，又称正常高值血压。目前我国高血压前期患病率为33.6%[1]。高血压前期发展成高血压和发生心血管病的风险是正常血压的2倍[2]。因此，应当在高血压前期进行积极干预，减少高血压和心血管病的患病率。从高血压前期进展到高血压的机制十分复杂，可能涉及神经调节(如自主神经、动脉压力反射和中枢神经系统)和体液调节(如肾素-血管紧张素系统)[3]。文献报道，有高血压家族史但血压尚正常的年轻人，其血压调节功能开始减弱，动脉压力反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)就已降低[4]。高血压前期患者动脉压力反射功能也低于正常血压人群[5]。这些研究提示动脉压力反射能力减退可能是高血压前期进展到高血压的重要机制。压力反射功能减弱主要发生在压力感受器和反射中枢。高血压前期压力感受器功能尚未改变时，压力反射功能减弱主要与反射中枢异常有关。

以往研究表明，压力反射中枢肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)激活和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)升高是压力反射功能降低的关键机制[6]。压力反射中枢主要分布在延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla，RVLM)、孤束核(nucleus tract solitarius，NTS)和下丘脑室旁核(paraventricular nucleus，PVN)。近年研究发现，高血压时，RVLM中血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2) 降低，而过表达ACE2能降低高血压[7]。ACE2主要作用是降解AngⅡ生成Ang(1-7)， Ang(1-7) 与其受体 MAS结合，对抗AngⅡ作用[8]。新近发现，高血压时RVLM和NTS脑区ACE2和MAS受体水平降低，运动训练可增强ACE2和MAS受体在RVLM中表达并增强NTS脑区MAS受体表达[9]。 Agarwal等[10]报道，运动训练降压与上调高血压大鼠RVLM及PVN脑区ACE2和MAS受体表达相关。这些研究结果提示，运动训练增强脑内ACE2-Ang(1-7)-MAS轴功能可能是运动降压的重要机制。但是，ACE2功能轴是否影响动脉压力反射目前尚不清楚，高血压前期运动训练对高血压进展和中枢血压调节的影响也鲜有报道。本研究旨在探讨高血压前期运动训练对高血压进程、血压调节以及中枢ACE2和MAS受体的影响，通过脑内给予Ang(1-7)及其拮抗剂，探讨ACE2-Ang(1-7)-MAS轴在延缓高血压进展中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要仪器和试剂

FT-200动物跑台、BL-420s机能实验系统和BP-300无创血压仪(成都泰盟科技有限公司)；68003单臂数字式脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；7500 PCR仪(ABI)；NanoDrop 2000核酸定量分析仪(Thermo)；垂直电泳转印系统和凝胶成像系统(Bio-Rad)。苯肾上腺素和Ang(1-7)(MCE)；A779(Genway)；SYBR试剂盒和PCR逆转录试剂盒(TaKaRa)；β-actin、ACE2和MAS引物由上海生工公司合成；兔多克隆抗ACE2抗体(Santa Cruz)；兔多克隆抗MAS抗体(Alomone Labs)；兔多克隆抗GAPDH抗体(沈阳万类生物科技有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research)；ECL发光液(GenView)。

2 方法

2.1动物及分组 5周龄雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和正常血压Wistar Kyoto(WKY)大鼠各20只均购自北京维通利华实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK(京)2012-0001。将SHR和WKY大鼠分别随机分成安静(sedentary， Sed)组和运动训练(exercise training, ExT)组(WKY+Sed、WKY+ExT、SHR+Sed和SHR+ExT组)，每组10只。饲养于福建医科大学实验动物中心。

2.2运动训练 5周龄大鼠适应饲养环境 1 周，测量基础血压。6周龄运动训练组大鼠开始跑台运动，采用本实验室已建立的有氧运动方案[11]，运动组大鼠跑台训练 60 min/d，18～20 m/min，每周训练5 d，共 20周。

2.3无创血压测定 采用尾套法测定清醒状态下大鼠尾动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)，2 周测量1次。

2.4动脉压力反射功能评估 运动结束后24 h～48 h，用氨基甲酸乙酯(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。股静脉插管用于给药，颈动脉插管记录血压和平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，记录Ⅱ导联心电图。静脉注射苯肾上腺素(phenylephrine，PE；8 μg/kg)，引起血压升高和反射性心率减慢，记录注药前后平均动脉压变化(ΔMAP)和心率变化(ΔHR)，术毕稳定30 min，检测压力反射敏感性(baroreflex sensitivity，BRS)以评估动脉压力反射功能，每组6只。BRS=ΔHR/ΔMAP[12]。

2.5侧脑室微量注射 为了明确运动训练是否通过Ang(1-7)影响动脉压力反射功能，在运动训练结束后，于侧脑室分别注射MAS受体激动剂Ang(1-7)和拮抗剂A779，记录给药前后BRS变化，每组6只。侧脑室注射点在前囟后0.8 mm，中线旁开1.4 mm，颅骨表面深3.8 mm。将微量注射器固定在三维操纵器上，侧脑室给药前，向侧脑室注射生理盐水(1 μL，3 min)作为对照，随后静脉注射PE，测定BRS。间隔20～30 min，然后侧脑室缓慢注射MAS受体激动剂Ang (1-7)(4×10-7mol/L)和阻断剂A779(5×10-7mol/L)，给药体积10 μL，注射时间3～4 min，给药结束后立即测定BRS。Ang(1-7)和A779给药间隔30 min。

2.6Real-time PCR检测ACE2和MAS的mRNA表达 根据大鼠脑图谱进行定位[13]，取各组大鼠RVLM、NTS和PVN组织各100 mg，每组4只。Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA。Real-time PCR 采用SYBR Green 染料法，反应总体积20 μL。PCR反应条件为95℃ 5 s、60℃ 34 s，共45个循环。以β-actin 作为内参照，采用2-ΔΔCt法进行数据统计。引物见表1。

表1 Real-time PCR反应的引物序列

2.7Western blot检测ACE2和MAS的蛋白表达 取RVLM、NTS和PVN组织约50 mg，加入RIPA 裂解液(含PMSF和蛋白酶抑制剂)， 制成10%匀浆液，4 ℃ 12 000×g离心20 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量。每泳道上样总蛋白50 μg，SDS-PAGE(12%分离胶、5%浓缩胶)后电转移至硝酸纤维膜上，用丽春红染色，依相对分子质量大小切取条带，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。洗膜后分别加入 I 抗 [ACE2(1∶1 000)和MAS(1∶2 000)]4 ℃过夜。次日洗膜后分别加入相应的ACE2 II 抗(1∶1 000)和MAS II 抗 (1∶3 000)，室温下孵育2 h。洗膜后加入ECL 显影，用凝胶成像仪扫描保存图像。Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行条带密度测定，以GAPDH作为内参照，目的蛋白/GAPDH条带密度比值表示目的蛋白表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异比较采用单因素方差分析，BRS比较采用析因设计方差分析，侧脑室注药前后BRS变化采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 运动训练对高血压进展的影响

运动前SHR和WKY大鼠间 SBP差异无统计学显著性。增龄过程中SHR+Sed组SBP逐渐升高，8周龄达(146.6±4.5)mmHg，同周龄SHR+ExT组SBP为(135.9±6.2)mmHg, 尚未进展为高血压。SHR+ExT组10周龄进展为高血压，SBP达(148.2±8.1)mmHg，但显著低于同龄SHR+Sed组(P<0.05)。随运动时间延长，SHR+ExT组SBP升高幅度明显小于SHR+Sed组，20周运动结束时， SHR+ExT组SBP比SHR+Sed组明显降低(P<0.01)。运动训练也降低WKY大鼠SBP，20周运动结束时， WKY+ExT组SBP亦明显低于WKY+Sed组(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The effects of 20 weeks exercise training on hypertension progression in SHR and WKY rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsWKY+Sed group;#P<0.05,##P<0.01vsSHR+Sed group.

图120周运动训练对大鼠高血压进展的影响

2 运动训练对动脉压力反射功能的影响

20周运动结束，SHR+Sed组的BRS明显低于WKY+Sed组[(0.7 ± 0.1)vs(1.9 ± 0.1)；P<0.01]，但SHR+ExT组的BRS明显高于SHR+Sed组[(1.6±0.1)vs(0.7 ± 0.1)；P<0.01]。WKY+ExT组的BRS与WKY+Sed组比较差异无统计学显著性。

3 运动训练对压力反射中枢ACE2和MAS mRNA及蛋白表达的影响

Real-time PCR结果显示， SHR+Sed组ACE2和 MAS的mRNA表达在RVLM、NTS和PVN等部位均明显低于WKY+Sed组(P<0.05)；与SHR+Sed组相比，运动训练显著增强SHR ACE2和MAS的mRNA表达(P<0.05)；运动训练对WKY大鼠ACE2和MAS的mRNA表达无明显影响，见表2。

表2 运动训练对压力反射中枢ACE2和MAS mRNA表达的影响

*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

Western blot结果显示， SHR+Sed组RVLM、NTS和PVN等部位ACE2和MAS的蛋白表达水平均明显低于WKY+Sed组(P<0.05)；运动训练显著增强SHR这3个部位的ACE2蛋白表达，使SHR+ExT组ACE2蛋白水平正常化；在NTS和PVN，SHR+ExT组的MAS蛋白表达不仅高于SHR+Sed组(P<0.01)，也高于WKY+Sed组(P<0.01)。运动训练对WKY大鼠这3个部分ACE2和MAS蛋白表达无明显影响，见图2～4。

Figure 2. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in RVLM. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

图220周运动训练对RVLM中ACE2和MAS蛋白表达的影响

4 侧脑室微量注射Ang(1-7)和A779对运动训练改善压力反射功能的影响

SHR+ExT组大鼠侧脑室注射A779后，对基础血压无明显影响，但给药后BRS较注药前明显降低(P<0.01)，抵消了运动改善SHR大鼠BRS的益处，但对SHR+Sed组大鼠的BRS无明显影响。侧脑室注射Ang(1-7)后可短暂降低SHR+Sed组和SHR+ExT组大鼠基础血压5 mmHg左右，与注药前相比，Ang(1-7)明显提高SHR+Sed组和SHR+ExT组的BRS(P<0.05)，见表3。

Figure 3. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in NTS. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05，**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

图320周运动训练对NTS中ACE2和MAS蛋白表达的影响

Figure 4. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in PVN. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

图420周运动训练对PVN中ACE2和MAS蛋白表达的影响

表3Ang(1-7)和A779对SHRBRS的影响

Table 3. The effects of Ang (1-7) and A779 on BRS in SHR (Mean±SD.n=6)

GroupA779Ang(1-7)Pre-injectionPost-injectionPre-injectionPost-injectionSHR+Sed0.67±0.100.67±0.200.58±0.201.38±0.20**SHR+ExT1.55±0.100.77±0.20**1.24±0.201.82±0.30*

*P<0.05,**P<0.01vspre-injection in the same group.

讨 论

1 运动训练对高血压进展及血压调节的影响

高血压前期的治疗以改变生活方式为主，有氧运动是主要治疗措施[3]。其他学者和本课题组前期研究均发现，适度运动具有降低血压、改善压力反射功能和减少高血压危险因素等作用[12，14-15]，但运动训练对高血压的预防作用及其机制报道甚少。本实验以SHR大鼠为研究对象，于高血压前期进行中低强度运动干预，并持续20周。结果发现，运动训练能延缓高血压发生时间窗，SHR运动训练组较SHR安静组推迟2周进入高血压。运动训练对SHR和WKY大鼠均有降压作用，对高血压大鼠的降压作用大于正常大鼠，这一结果提示，始于高血压前期的运动训练虽然不能阻止高血压发生，但明显推迟高血压发生时间窗，并降低高血压幅度。运动训练降压机制较为复杂，目前尚未完全阐明。动脉压力反射是体内重要的血压调节机制，运动训练恢复动脉压力反射功能和改善压力反射敏感性是运动降压的关键机制[12, 15 ]。这是因为动脉压力反射能适时监测血压变化，通过负反馈机制维持动脉血压相对稳定。对于正常人或高血压前期人群，压力反射功能受损增加患高血压风险。高血压患者压力反射功能减弱，血压变异性增大，发生心脑血管意外事件风险增加，提示预后不良[16]。本实验发现，始于高血压前期的运动训练也能增强动脉压力反射功能，提高血压调节作用，这可能是运动训练延缓高血压进展的机制之一。

2 运动训练对压力反射中枢ACE2-Ang(1-7)-MAS轴功能的影响

研究表明，脑内RAS激活，AngⅡ兴奋RVLM、PVN等处前交感神经元，一方面交感神经传出活动增强，另一方面抑制压力感受器传入信号(感受器传入信号抑制RVLM交感神经活动)，升高血压[5-6]。ACE2主要功能是降解AngⅡ生成Ang(1-7)，后者与MAS受体结合，构成ACE2-Ang(1-7)-MAS轴，以对抗ACE-AngⅡ-AT1轴作用[8]。本研究观察到SHR安静组RVLM、NTS和PVN等处ACE2 mRNA表达较WKY安静组降低约40%～60%， ACE2 蛋白表达也较WKY安静组降低了35%～43%。 Yamazato等[7]也报道SHR RVLM处ACE2 mRNA较WKY明显降低。运动训练显著提高SHR ACE2 mRNA和蛋白表达，并使之正常化。运动训练不仅上调心血管中枢ACE2表达，而且也增强主动脉[17]和心脏组织[18]ACE2表达。对于MAS受体，SHR安静组上述3个部位MAS的mRNA和蛋白表达均明显低于WKY安静组，运动训练显著上调SHR MAS的mRNA和蛋白表达，SHR运动组这3个部位的MAS 蛋白表达较SHR安静组提高了1.0～1.5倍。Ren等[9]和Agarwal等[10]报道，高血压大鼠进行12～16周运动训练后，不仅降低高血压，而且增强ACE2和MAS在RVLM、NTS和PVN的表达， 但没有观察对压力反射功能的影响。Lopes等[19]报道， 运动训练联合ACE2激动剂能改善高血压大鼠压力反射功能。因此，其他学者和本实验结果均提示，运动训练增强脑内 ACE2和MAS表达可能是运动训练改善高血压大鼠压力反射功能的分子机制。Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-MAS轴的枢纽，运动训练能增强心肌组织Ang(1-7)水平[18]。由于本实验未检测脑内Ang(1-7)水平，为了解运动训练对Ang(1-7)影响，采用侧脑室注射Ang(1-7) 拮抗剂A779，结果发现，A779抵消了运动改善SHR BRS的作用，而Ang(1-7)能提高SHR安静组和运动训练组BRS。这一结果间接证明Ang (1-7)介导了运动训练改善压力反射中枢调节的作用。

综上所述，本研究的结果表明，始于高血压前期的运动训练具有降低高血压、改善动脉压力反射功能及增强中枢ACE2-Ang(1-7)-MAS轴功能等作用，这可能是运动训练延缓高血压进展的中枢机制。

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