呼吸道疾病与细菌组学

孔忆秋， 李 言， 张 永

1 背景

在医学领域，随着高通量测序等生物技术的发展，人们越来越认识到在人体体表和肠腔器官拥有丰富的微生物群落——微生物组，参与人体免疫调节、食物消化、维生素合成等一系列生命活动。而众多疾病的发病机制涉及到微生物群落的组成和行为的改变，如胃肠道炎症性疾病、AIDS相关的机会性感染、呼吸系统疾病、某些肿瘤等。人体微生物组拥有数量惊人的微生物数量（人体细胞数量10倍之多）及基因数量（人体基因的100多倍）。目前，微生物组与临床疾病研究主要集中在炎症性肠病、糖尿病、过敏性疾病等。随着非培养生物分子生物技术等发展，人们认识到健康的肺部并非无菌，而呼吸道的微生物组群与多种呼吸道疾病有着特殊的关联。

2 微生物组研究方法

分离培养是研究微生物的传统检测和鉴定方法，但是人体和环境中绝大多数的微生物并不能通过该传统方法获得。因此，以高通量测序为代表的非培养分子生物技术逐渐成为目前研究微生物组的标准方法。该技术通过对样本中微生物的用于系统分类标记的DNA序列[细菌和古生菌的16S rRNA、真菌的内转录间隔区（ITS）等]进行测定获取海量基因序列信息，并通过多种复杂的生物信息学统计分析，可以进行物种鉴定，从而揭示环境和人体微生物种群的相对丰度、进化关系或系统分类[1]。16S rRNA基因测序已成为目前细菌群落研究最常用的方法[2]。16S rRNA基因数据库目前正飞速增加，为微生物鉴定和微生物群落研究提供了有力的数据支持。随着非培养分子技术等微生物组研究方法的进步与应用，人体微生物组海量的多样性和高度的个体性才得以全面展示并深刻改变了人们的认识。

3 呼吸道特征及环境

传统“肺内无菌”的观念是基于健康人群支气管肺泡灌洗液（ΒALF）和痰液的阴性培养结果得出的[3]。但这种观念最早由Hilty等[4]提出质疑。事实上，越来越多的研究证实健康人群呼吸道微生物组的多样性和复杂性[5-6]。

3.1 健康呼吸道细菌组特点

关于健康人体肺部微生物组的主要微生物组成大体是一致的。2010年，Hilty等[4]首次将高通量测序技术应用于健康受试者ΒALF中细菌检测，他们发现：①健康人上、下呼吸道都存在相近的菌群；②呼吸系统疾病可以改变菌群种类，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者呼吸道内变形菌纲（Proteobacteriae）的丰度增加。其他研究也不断发现并证实呼吸道拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（F i r m i c u t e s）、普雷沃菌属（Prevotella）、韦荣球菌属（Veillonella）、链球菌属（Streptococcus）等优势菌群[5，7]。这些肺部菌群更接近于口咽菌群[7]，推测与食管反流、喉功能性障碍，或者口腔卫生相关。放射性示踪研究表明，即使健康人群也会发生睡眠中微量误吸现象[8]，尤其当平卧和咳嗽反射抑制时[9]。此外，肺微生物组成还可能存在昼夜节律或区域差异[10]。

3.2 肺炎

肺炎是远端气道、肺泡和肺间质的感染性炎症。Dickson等[11]对比ΒALF传统的定量培养和非培养的基因测序，结果发现两者在细菌负荷、群落多样性等变化高度一致。因此，ΒALF基因测序可以确定肺炎患者肺泡中存在细菌的种类[12-13]，责任病原菌种类一般占检测序列的75%以上。传统的肺炎发病模型是：某种致病菌入侵无菌的健康肺脏，打破了局部的防御能力，呼吸道内不断生长导致肺炎的发生。但肺脏微生物组的发现逐渐颠覆了我们对肺炎发病机制的认知[14]：健康的下呼吸道由多种微生物——其中包括潜在的致病菌——组成动态稳定的生态系统，肺炎的发生也不是病原体入侵进入肺部引起，而是微生物种群在特殊情况下的多样性降低或部分微生物丰度增加，并引起机体炎性反应，从而打破机体生物多样性稳态和免疫稳态而致使疾病的发生。已有多个研究支持这一观点[4、15-16]。

3.3 哮喘

支气管哮喘是气道慢性炎症性疾病。已有研究发现儿童早期抗生素暴露与哮喘、过敏症之间高度相关[17]，早期人体正常微生物稳态的改变或破坏可能是重要原因。通过比较哮喘、COPD患者与健康对照组口腔、鼻腔和ΒALF标本的微生物构成，Hilty等[4]发现哮喘患者呼吸道中变形菌纲丰度增加[如：流感嗜血杆菌（Haemophilus）、莫拉菌属（Moraxella）和奈瑟菌属（Neisseria）等]，而拟杆菌门丰度减少。随后，Huang等[18]通过研究比较65例难治性哮喘患者和10例健康对照者发现：哮喘患者在细菌总量和部分细菌（如变形菌纲）的丰度均高于健康对照者，其中多种微生物与气道高反应性的程度之间存在正相关关系。因此，肺部的微生物可能在气道变应性疾病中发挥潜在的作用。

3.4 COPD

COPD是另一种气道炎性反应异常的疾病。非气管插管的COPD患者气道的流感嗜血杆菌明显增多，而拟杆菌门相对减少[4]。但一项小样本研究虽然发现中重度COPD患者气道微生物种类多样性轻度下降，却未发现COPD患者、吸烟者和非吸烟者的ΒALF菌群组成有显著差异[19]；有关COPD气管插管研究却发现，抗生素治疗总是伴随着细菌种类的多样性降低，最终铜绿假单胞菌成为优势种群[18]。另一项小样本COPD机械通气研究发现，尽管接受一段时间抗生素治疗，患者气道微生物组群多样性仍然存在，但随着气管插管持续时间延长，其多样性随之下降[16]。上述研究虽然结果互相矛盾，但可能从微生物组改变的角度提示了COPD急性加重的发生机制。此外，气道细菌组和病毒组的交互作用在COPD急性加重中作用不能忽视。D'Anna 等[20]的研究结果表明，稳定期COPD患者气道内仍可检测出病毒，并与细菌维持着气道的慢性炎症状态，病毒的载量决定着慢性炎症的严重程度。另有一些研究发现，有些细菌，如变形菌门也可以轻易激发COPD患者的气道炎症[21-22]。但目前仍不清楚呼吸道病毒或细菌的感染/定植是如何引起肺内正常菌群变化的。

3.5 囊肿性纤维化（cystic fibrosis，CF）和支气管扩张症

CF和支气管扩张都属于感染相关性结构性肺病。CF特征性的浓稠黏液是细菌繁殖的理想场所，从而引起反复感染和肺组织病变。一般认为，CF慢性感染常见的细菌有金黄色葡萄球菌、洋葱伯克霍尔德菌和铜绿假单胞菌等[23]。但利用基因测序检测发现：口腔厌氧菌（oral anaerobes），如普氏菌属、韦荣球菌属、罗氏菌属（Rothia）等也较常见[24]。也有学者认为痰液微生物组多样性降低，以及厚壁菌门与拟杆菌门比率升高是CF的特征性改变[25]。而气道细菌多样性降低可能与气道炎性反应、疾病进展及不良预后相关[26-27]，类似现象在肠道微生物组学研究同样存在[28]。Al-momani等[29]通过高通量测序发现CF患者痰标本和胃液标本具有高度相似的细菌谱，而非CF患者并无此特点；进一步研究发现，CF患者胃肠道常见细菌[如拟杆菌属和柔嫩梭菌（Faecalibacterium）]丰度明显降低，而假单胞菌（Pseudomonas）明显增多。

支气管扩张症也有明显的呼吸道微生物种群改变，如变形菌门、流感嗜血杆菌和假单胞菌属的丰度相对增高[30-31]，并与气道炎性反应的关键炎症介质——基质金属蛋白酶增高显著相关[31]。因此，这种正常菌群丰度降低常常使得致病菌更容易定植或感染，引起或维持肺内炎性反应和组织损伤。

3.6 特发性肺纤维化

特发性肺纤维化是一种进行性、原因不明的慢性间质性肺疾病。通常很难将微生物与特发性肺纤维化的发病机制联系起来，但一些临床研究和非培养技术发现了微生物在该病中的作用。比如：接受了甲氧苄啶-磺胺甲唑治疗的特发性肺纤维化患者的病死率有所下降[32]；特定微生物群落如葡萄球菌属和链球菌属丰度相对增加与疾病进展呈正相关[33]；另有研究发现ΒALF细菌载量是患者死亡的独立危险因素[34]。这些研究提示对呼吸道微生物组的某些干预可能是该类疾病值得关注的防治措施。

3.7 有创通气对呼吸道菌群的影响

肺微生物组主要来源于口咽部的常驻菌群[6，35]，气管内插管和意识丧失可能会大大加剧体内菌群迁移。肺部严重疾病极大地改变肺部微生物的生长环境，如肺水肿、肺内氧含量和温度梯度改变以及应激反应信号分子刺激作用，肺泡将转变为适合病原体生长的富营养状态；危重患者的呼吸与消化道动力学存在异常改变等。危重病患者消化道内大量微生物可成为口咽部和肺内微生物的主要来源[6，36]。Kelly等[37]采用16S rRNA基因测序方法对有创通气患者的咽和内气管分泌物分析发现：早期机械通气患者的上、下呼吸道菌群的多样性开始降低，并随着插管时间延长而进一步减少。在一些情况下，基因测序检测出传统细菌培养未能培养出的优势菌群，如微小脲原体和粪肠球菌。

3.8 消化道与呼吸道微生物组的相互关系

近年一些临床观察和实验提示，除了呼吸道内的微生物，消化道内的微生物对于维持肺部炎症和抗炎免疫反应之间的稳态也有着深远影响。有一些关于人类肠道菌群对过敏性疾病和免疫耐受影响的研究提出了“卫生”和“生物多样性”假说[38-40]。Dickson等[41]的研究结果表明，呼吸窘迫综合征患者和脓毒症小鼠模型等呼吸道微生物组群中以肠道菌群为主。脓毒症的实验中生态分析提示脓毒血症发生后肺部感染等细菌来源主要是下消化道，而不是上呼吸道。采用非培养分子生物技术检测呼吸窘迫综合征患者的ΒALF发现：肠道内特有的细菌普遍大量存在，如拟杆菌属，且与全身炎性反应的强度呈正相关。关于消化道内微生物在呼吸系统疾病发病机制中所扮演的角色及其对疾病预后的影响有待进一步研究，并对疾病诊疗提供新方法。

4 问题与展望

人体微生物组群具有高度复杂性和特异性，高通量测序技术为微生物组研究提供了可靠和精准的手段。人们逐渐认识到人类肺部微生物组的存在，并在健康肺脏和肺部疾病中发挥着重要作用。相对于人体消化道等部位的微生物组学研究，肺微生物组学研究起步较晚，涉及肺微生物组的多数研究均存在样本量少、评价不够全面、缺乏大样本或多中心研究。除此之外，呼吸道微生物组研究目前还需阐明一些关键问题，如呼吸道微生物组之间的相互关系、呼吸道微生物和消化道微生物之间的关系、慢性肺部疾病时呼吸道内微生物组群特点及影响、急重症呼吸道疾病的微生物组变化等。因此，未来呼吸道微生物组研究需要招募更多的患者和健康人群以增加临床信息量，使得研究结果更具有普遍性。这将有助于更好地了解微生物组在肺部疾病发生时的动态变化及其作用，从而为患者制定精准诊疗计划、提高临床疗效、控制疾病发展提供新颖的思路和方法。

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