骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑中的作用

陈德龙 陈鹏 邓章荣 姜山 王粤淇 王海彬

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

近年来，组织工程学应用于骨组织再生和修复方面显示了巨大的前景，而成骨细胞、破骨细胞及干细胞在其中发挥着重要的作用。正常骨组织由骨细胞和骨基质共同组成，通过骨重塑来维持内稳态的平衡及自身结构的完整，其中成骨细胞(骨形成功能)和破骨细胞(骨吸收功能)之间的动态平衡是骨重塑过程中最关键的环节。2007年，Valadi等发现细胞分泌的外泌体中含有生物活性mRNAs、microRNAs(miRNAs)、脂质和蛋白质，这使得研究人员对外泌体的研究热情激增。随着研究的进展，科学家发现外泌体在细胞间通讯及局部微环境的调节中发挥着特殊作用，因此本文对成骨细胞、破骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑中的作用作一综述。

1 外泌体的内容与功能

1.1 形态与来源

外泌体是由细胞内吞系统的多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径为 30 ～100 nm 的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)[1,2]。透射电子显微镜下外泌体呈扁平状或球状[3]，在蔗糖溶液中的密度为1.13 ～1.19 g/mL， 其密度与细胞来源相关，并随蛋白含量而改变[4]。外泌体最早由Johnstone等[5]在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现。后来研究发现，不仅网织红细胞能释放这种小囊泡，几乎所有类型的活细胞都能分泌，例如T细胞[6]、巨噬细胞[7]、肥大细胞[8]、内皮细胞[9]、施旺细胞[10]、神经细胞[11]、肿瘤细胞[12]等。

1.2 外泌体的内容

外泌体含有蛋白质和核酸，Valadi等在2007年发现外泌体中含有RNA。同时，外泌体中包含了多种多样来源于其分泌细胞的成分，包括蛋白、脂质(lipids)、mRNAs和microRNAs(miRNAs)。多种细胞来源的exosomes内均包含mRNA和miRNA，并且诸多研究已证实它们在exosomes参与细胞之间信息传递的作用机制中确实起到重要作用。根据一个专门收录与exosomes研究相关的数据库 ExoCarta (http: //www．exocarta．org /) 中的信息，现已发现的exosomes相关蛋白质有41 860种，RNA的种类超过7540和有1 116种脂质分子[13]。外泌体的组成与细胞来源相关，不同种类的细胞外泌体的组成不尽相同[14]。外泌体蛋白质的组成与细胞类型和组织特征相关，已通过Western印迹、荧光激活细胞和电子显微镜进行了广泛的分析。外泌体富含热休克蛋白(HSP70，HSP90)[15]和膜联蛋白(膜联蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅺ)，有助于膜运输和融合[16]。外泌体也富含运输蛋白，如微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合分子[17]以及与分泌细胞特定功能相关的几种蛋白质[15]，如MHC II(抗原呈递细胞分泌的)[18]和CD86(抗原呈递细胞)[19]。此外，外泌体含有高浓度的跨膜4蛋白家族(CD9、CD63、CD81)和肿瘤易感基因101(TSG101)[20]。在体外研究发现，CD9和CD82能抑制肿瘤细胞迁移和侵袭[21]。

除了蛋白质，外泌体还含有脂质，DNA, mRNA, miRNA和lncRNA，参与细胞间信息交流[22]。MiRNAs是非编码RNA(non-coding RNAs)家族中的重要一员，大约有17～24个核苷酸长度，通过与目标mRNA上的3’非翻译区(3’UTR)结合来调控翻译后的基因沉默，进而抑制相关基因的表达[23]。miRNAs 是外泌体中的主要小RNA，当其他细胞“吞入”这些含有 RNA 的外泌体后，mRNA可以在受体细胞中翻译出相应的蛋白质，microRNA 通过降解mRNA或者抑制mRNA的翻译来调控蛋白质在目标细胞中的表达，而siRNA可以敲除受体细胞中的目标基因达到基因沉默的作用。这种运输模式使外泌体中的miRNA可抵抗来自RNAase的降解作用[24]。外泌体第二主要RNA为lnRNAs(长非编码RNA，>200 bp)，通过用基因组DNA退火或修饰组蛋白复合物干扰基因表达[25]。在微环境中，外泌体表现为介导RNA的载体并递送其内容物和调节受体细胞蛋白的产生。

1.3 生物学功能与作用

外泌体为细胞间通讯的载体，并且在细胞之间转输脂质、核酸(mRNA和miRNA)和蛋白质，可以在受体细胞中引起生物学反应和表达内容物生物学效应[26]。外泌体和其他生物囊泡之间的主要特征之一是存在大量的核苷酸。外泌体miRNA在双重脂质膜保护下可以避免RNA酶降解，保持其生物活性，并稳定存在于体液(血液，唾液，尿液)中[27-29]，可作为早期发现疾病的生物标志物。此外，外泌体通过无创的方式获得，有利于临床的推广与运用。

近年来，越来越多地报道间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的外泌体作为主要的治疗剂，但是，目前干细胞分泌的外泌体缺乏临床运用的报道，却在再生医学中已经表现出未来的潜力。

2 外泌体与骨重塑

2.1 促进成骨及血管化

体细胞(间充质干细胞及骨细胞)来源的外泌体在骨重塑中起着重要的作用。Xu等[30]发现人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分泌的外泌体miRNAs在骨重塑的过程中存在明显表达差异(let-7 a，miR-135b，miR-148 a，miR-199b，miR-203，miR-218，miR-219，miR-299-5p和miR-302b)，从另一方面表明了干细胞调控骨重塑的机制。其中外泌体miR-196 a通过调控成骨基因ALP，OCN，OPN 和Runx2的表达促进成骨分化进而促进骨折愈合。而且，人脐带来源间充干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells hUCMSCs)分泌的外泌体可以启动hBMSCs的成骨分化，并且上调骨形成相关基因的表达，包括ALP，BMP2，OCN，Osterix，Col1α和Runx2[31]。更令人欣慰的是，外泌体还能促进生物材料的成骨作用[32]。Zhang等[33]报道外泌体通过PI3K/AKT通路增加β磷酸三钙(β-TCP)的成骨诱导能力。不仅如此，外泌体还能促进血管生成进一步促进骨形成。人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)来源的间充干细胞分泌的外泌体能具有显著促进血管生成的能力，进一步增加细胞的增殖能力、上调成骨相关基因OPN，RUNX-2和COL1 在基因和和蛋白水平的表达[34]。而且，在体内颅骨骨缺损大鼠模型中，hiPSC-MSC-Exos +β-TCP复合支架通过增强血管的新生达到促进颅骨缺损的骨再生[33]。

2.2 抑制骨形成

作为细胞间通讯的介质，外泌体在抑制骨形成中的作用表现为降低成骨细胞功能和促进破骨细胞活性两方面。文献报道[35]，骨质疏松患者的血清中，外泌体中MiR-214和ephrinA2水平呈高表达状态，这有可能显著抑制了成骨细胞活性加重病情；在骨性关节炎的病理变化中，炎症细胞通过促进破骨细胞衍生的外泌体miR-214-3p的转移，来抑制成骨细胞的功能，进一步促进关节下骨的侵蚀[36]。外泌体对破骨细胞的影响同样受到广泛重视。破骨细胞分泌的细胞外囊泡含有let-7e，miR-21，miR-155，miR-210，miR-223和miR-378[37]。MiR-223抑制核因子I-A(NFI-A)的表达并控制破骨细胞分化。 NFI-A水平的下调影响M-CSFR的表达，这对于破骨细胞分化和功能至关重要[38]。MiR-210通过抑制TGF-β /activin信号通路和靶向AcvR1b受体调节成骨细胞分化[39]。MiR-155，干扰素-β诱导的miRNA，通过靶向SOCS1和MITF两个破骨细胞形成的基本调节因子，抑制破骨细胞分化[40]。在MSC成骨分化过程中，MiR-21表达会被TNF-α抑制，而阻断TNF-α可以显着增强miR-21的表达和增加骨形成，并且抑制了Spry1的表达，这是FGF和ERK-MAPK信号通路的负调节因子[41]。

3 总结

外泌体作为机体内普遍存在的纳米级、扁平状、双层脂膜结构，广泛参与细胞间的交流。成骨细胞、破骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑过程的动态耦联平衡起着至关重要的作用，可为临床治疗骨缺损、骨不连、骨质疏松等疾病和骨修复材料的设计提供新的方向。但目前外泌体的研究尚停留在体外试验及动物实验中，缺乏临床运用的报道。随着研究的深入，外泌体作为基因分子治疗骨科疾病将会成为新的里程碑。