甲状腺结节细针穿刺分子标志物的研究进展

综述 审校

近年来，甲状腺结节发病率逐年上升，应用高分辨率超声（ultrasound，US）筛查其在成人中的发病率高达68%［1］。引起发病率上升的原因是多方面的，有研究提出US诊断设备的不断普及发展，高分辨率US及其他影像工具广泛应用于甲状腺是大量结节被检出的重要因素［2］。虽然，甲状腺结节发病率较高，但恶性结节比率却较低，为1.6%～12%［3］。US是甲状腺结节筛查与术前诊断的最佳影像学手段［2］，多个专业的学术组织及多篇文献均认为甲状腺结节的超声特征较为广泛［4］。因此，结节性质的确定往往需要超声引导下细针穿刺细胞学检查（fine needle aspiration biopsy，FNAB）。FNAB是甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断的最基本也是最佳手段［5］。目前，甲状腺结节细胞病理学多采用Bethesda报告系统，虽然大样本病例数据研究［6-8］支持Bethesda系统具有很好的组间一致性，89%～95%的样本取材满意，其中55%～74%判断为良性病变，2%～5%判断为恶性病变。但仍然有近30%的病变难以得出确切的判断［4］，其中包括意义不明确的非典型病变（AUS）或是2%～18%非典型的滤泡性肿瘤（FLUS），2%～25%滤泡性肿瘤，1%～6%可疑恶性（suspicious for malignancy，SUSP）［8-9］。近年来，甲状腺结节细针穿刺（fine needle aspiration，FNA）分子标志物检测的出现为解决上述问题提供了一种新的特异性的辅助诊断方法［10］。目前研究较多的分子标志物主要为BRAF基因突变、RAS基因突变、RET/PTC基因重排和PAX8/PPARγ基因重排等；以及使用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测的半乳糖凝集素3（galectin-3，Gal-3）、细胞角蛋白19（cytokeratin-19，CK-19）、人类骨髓内皮细胞（human bone marrow endothelialcell-1，HBME-1）。本文对FNA分子标志物目前的一些研究进展进行综述。

1 突变和重排基因

1.1 BRAF基因突变

BRAF基因位于第7号染色体，是RET-RAS的下游信号分子，通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路和抑制促凋亡因子BIM，导致细胞异常增殖和分化。BRAF基因的致癌性转换是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）最常见的遗传性事件，约占45%［11］，在低分化甲状腺癌（thyroid cancer，TC）和未分化甲状腺癌（anaplastic cancer，ATC）中，分别占 33%和 45%［12］。90%以上的突变发生在15号外显子的1 799密码子上［11］，发生从胸腺嘧啶至腺嘌呤的颠换，导致残基600（V600E）中谷氨酸替代为缬氨酸。有报道［13］提示在甲状腺良性结节与甲状腺正常组织中BRAF基因突变并不存在，其是PTC特异性的基因突变类型［13］，有着强大的致癌作用。有研究［14］表明，对于腺外侵犯、淋巴结转移和分期较高等与PTC复发、死亡有关的因素，均与BRAF基因突变密切相关。Patel等［15］研究证明即使在Ⅰ期PTC中，BRAF基因突变与其复发也有较显著的关系。高柱状细胞亚型（tall cell variant，TCV）是PTC发生BRAF基因突变最为常见的病理亚型，而滤泡型甲状腺乳头状癌（follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC）较为少见。BRAF基因突变还可引起甲状腺激素合成及碘代谢相关基因的表达下降［16］，导致钠碘转运体（sodium iodide symporter，NIS）的失调［14］，这可能与部分TC及其转移病灶放射性碘摄取能力丧失相关。这表明BRAF基因突变也可作为患者的预后评价指标［17］。BRAF基因突变对TC的诊断特异度为＞99%［18］，尤其适用于FNAB诊断不能确定的情况，并提高其准确性［19］。一项包含了 47 项研究的荟萃分析显示［20］，BRAFV600E在FNA穿刺物中的检测率为52%（39%～64%）；在FNAB结果不确定组中，BRAF基因突变对恶性肿瘤的灵敏度仅为30%；但是，在可疑恶性组中为52%。可见，BRAF基因突变对于PTC的诊断灵敏度较低，特异度较高。此方法有其局限性：1）灵敏度较低［21］；2）BRAFV600E突变仅与PTC相关，与其他病理类型甲状腺癌不相关［22］。

1.2 RAS基因突变

RAS家族成员包括HRAS、KRAS和NRAS，编码3种不同的膜相关鸟苷酸结合调节蛋白，主要影响生长因子受体信号通路，参与调节细胞的生长和分化。激活后，RAS释放GDP，GDP与GTP结合，进而增加MAPK通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路的转导［23］，从而导致肿瘤形成。RAS基因突变是分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）中第二个常见的遗传性事件［11］，主要存在甲状腺滤泡癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）和FVPTC（40%～50%）中［24］，尤其常见于缺碘地区，而在典型的PTC（10%）中较少见［25］。同时，RAS基因突变也可见于20%～40%滤泡性肿瘤（follicular adenoma，FA）［12］，然而RAS基因突变阳性的FA是否更有可能进展为癌症仍不清楚，因此不应单独检测RAS基因突变预测甲状腺肿瘤的恶性风险［26］。可见，RAS基因的突变反映了甲状腺肿瘤形成过程中的早期事件。已有研究证明，RAS基因突变的FTC患者更可能存在远处转移和拥有更高的死亡率［27-28］。一项荟萃分析显示［29］，在FNAB诊断不能确定的情况下，FNA穿刺物RAS基因突变对恶性肿瘤的灵敏度为34.3%，特异度为93.5%。目前对FNA穿刺物应用RAS基因突变进行诊断性检测尚有争议：1）诊断难点为良性滤泡性腺瘤或增生与分化良好的滤泡性癌的鉴别；2）RAS基因突变可能诱发腺瘤或增生向甲状腺滤泡性癌的转变［24］。

1.3 RET/PTC基因重排

RET原癌基因在正常甲状腺组织中滤泡旁C细胞高表达，并编码一种细胞膜受体酪氨酸激酶。目前，已知的RET/PTC基因重排类型有13种，所有的形式均由3′部分的RET基因和5′部分不同的基因所融合。TC中最常见的重排类型是RET/PTC1和RET/PTC3，前者由H4（CCDC6）-RET融合而成，与高分化型有关，并且预后良好，而后者由NCOA4（RFG）-RET融合形成，与侵袭性肿瘤关系较密切［30］。RET原癌基因激活可导致甲状腺滤泡细胞的恶变，可引起MAPK下游通路的持续激活，并增强信号转导。RET/PTC基因重排不仅存在于几乎所有的家族性甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）、部分散发性MTC以及部分PTC中，也存在于甲状腺良性结节中［31］。但涉及大量肿瘤细胞的RET/PTC基因重排对PTC而言具有特异性。只要有高质量RNA，通过逆转录PCR就可以在FNA穿刺物中检测到RET/PTC重排。Ferraz等［32］证实了从常规FNA涂片中检测RET/PTC重排的可行性。RET/PTC基因重排在PTC的FNA穿刺物中发生率为5%～35%，致使这种突变不适于单独筛查甲状腺癌［23］。并且，Wang等［33］研究发现，RET/PTC基因重排在中国人群PTC中发生率较低，与年龄相关（年龄越大发生率越低）；而且RET/PTC1和RET/PTC3均与不同的临床病理特征有关，但与淋巴结转移无关。Rodrigues等［34］综合了95篇有关FNA样本分子标志物的文献，显示FNA穿刺物中RET/PTC重排灵敏度为18.20%，特异度为88.73%。

1.4 PAX8/PPARγ基因重排

PAX8/PPARγ基因是由配对盒基因8（paired box 8，PAX8）与过氧化物酶增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR）γ融合而成，并被认为是FTC最常见的融合基因［35］。PAX8/PPARγ基因重排在FTC中阳性率为30%～35%、FVPTC中为38%，也可见于一些FA（2%～13%）中［36］，因此其不应单独用于诊断甲状腺恶性肿瘤。PAX8/PPARγ基因重排会引起细胞的过度增殖和分化，该基因阳性FTC倾向于发生在具有血管侵袭特征的年轻患者中［37］。Chia等［38］的研究中却发现，FTC的PAX8/PPARγ阳性率仅11.1%，与以往西方人群中的统计数据差异较大，可能是由于种族及地区差异所致。与RAS阳性FA相似，PAX8/PPARγ阳性的FA可能实际上表示原位癌（浸润前的FTC）。PAX8/PPARγ基因重排可通过逆转录PCR或FISH分析进行准确的检测。因此，若在滤泡性肿瘤的FNA穿刺物中证实存在该改变，在病理诊断时一定要更仔细地检查是否存在包膜血管浸润。Rodrigues等［34］研究显示FNA穿刺物中PAX8/PPARγ重排特异度为20%，灵敏度为100%。

2 免疫组织化学标志物

IHC已被广泛用于临床试验，理论上是鉴别甲状腺结节良恶性的理想方法之一。虽然，目前研究的IHC诊断标志物很多，但可应用于FNA标本的较少。尽管各研究中标志物的灵敏度及特异度并不稳定，但其可作为诊断良恶性甲状腺结节的辅助方法［39］。

2.1 Gal-3

Gal-3是分化良好的TC最准确的独立标志物，也是目前应用最广泛的标志物之一［40］。Gal-3是一种参与细胞生长、黏附、分化、肿瘤进展和凋亡的内源性凝集素，其在TC细胞核和细胞质中显色［41］。Gal-3在FNA样本中区分甲状腺良恶性肿瘤方面的潜在诊断价值已在一项大型前瞻性国际多中心研究［42］中被证明，其在鉴别甲状腺良恶性肿瘤中的灵敏度、特异度、阳性预测值和诊断准确性分别为99%、98%、92%和99%，这表明Gal-3表达分析是有效且可靠的。另一项多中心研究［43］显示，Gal-3在应用FNA样本区分FTC和FA中灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值以及精确度分别为78%、93%、82%、91%和88%。Gal-3在PTC的FNA样本中同样强烈表达［44］。此外，淋巴结反应性增生和转移之间Gal-3表达有显著性差异［45］，然而Gal-3在转移病灶中的表达比原发病灶低。Gal-3表达与TC预后因素之间也有显著相关性，FNA样本中无Gal-3表达与PTC的早期阶段（即低侵袭性）和淋巴结转移较少相关［46］。Gal-3检测并不能代替传统的FNAB检查，但是可用于不确定的滤泡性肿物的补充诊断。

2.2 HBME-1

HBME-1是一种针对间皮细胞表面抗原的单克隆抗体，也被认为是辅助FNAB用以区分甲状腺良恶性肿瘤的IHC标志物。HBME-1和CK-19清晰的细胞质和细胞膜着色具有诊断意义［41］。一项聚焦于滤泡性甲状腺肿瘤的研究［47］显示，应用FNA样本检测HBME-1对于鉴别其良恶性的灵敏度和特异度分别为66.7%和90.6%。另一项研究［48］应用FNA样本检测HBME-1，预测PTC的灵敏度和特异度分别为87.5%和86%。然而，FVPTC没有经典型PTC明显的细胞核改变，于是Ohta等［49］对HBME-1在FVPTC中的检测效能进行了评估，其灵敏度和特异度分别为92%和89%。由此可见，HBME-1在鉴别甲状腺良恶性肿瘤中为敏感性标志物。

2.3 CK-19

CK-19主要用于标记单层上皮细胞，更多的用于腺癌诊断。CK-19在PTC中弥漫表达，而在FTC和其他良性病变中是点灶状表达、低表达或者不表达［50］。一项聚焦于滤泡性甲状腺肿瘤的研究［47］显示，应用FNA样本检测CK-19对于TC诊断的灵敏度和特异度分别为90.5%和75%。Saggiorato等［51］应用IHC检测了125例FNAB不能明确诊断的FNA样本，发现CK-19诊断TC的灵敏度为76%，特异度为90%；而当Gal-3和CK-19联合用于诊断24例甲状腺嗜酸性细胞瘤时，灵敏度和特异度可达100%。Ratour等［52］应用FNA样本联合检测CK-19和HBME-1诊断TC的灵敏度、特异度、阴性预测值和阳性预测值分别为100.0%、85.2%、100.0%和87.2%。另外，Cochand-Priollet等［53］对150例FNA样本进行HBME-1与CK-19联合检测时，发现其诊断TC的灵敏度为100%，特异度为85%。可见，联合应用各种IHC标志物，有助于术前协助诊断TC。

3 结语

无论是IHC还是基因检测对于FNAB不能确诊的甲状腺结节均有重要的临床价值。但目前尚存在单一标志物灵敏度及特异度欠佳、检测技术较高、花费较多等因素，大部分分子标志物检测未在临床广泛开展。随着分子生物学的不断进步，多种分子标志物联合检测可提高FNAB诊断的灵敏度。现在，已经有各种针对FNA样本多基因检测的试剂盒面世，或可作为FNAB的辅助检查，成为对结果为意义不明确的细胞非典型病变、可疑滤泡性肿瘤、可疑癌等的甲状腺结节定性的重要工具。