兔巴氏杆菌病病原菌的分离及生物学特性的鉴定

郑丽丽，杨 威 ，逯纪成，孟 艳 ，杨旭光，王 迈 ，杨聪伟

（1.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000；2.保定市动物疫病预防控制中心，河北 保定 071000；3.衡水市动物疫病预防控制中心，河北 衡水 053000；4.石家庄市动物卫生监督所，河北石 家庄 050000；5.衡水市饶阳县畜牧局，河北 衡水 053000）

兔巴氏杆菌病（Rabbit Pasteurellosis）是由多杀性巴氏杆菌引起的，也是一种人畜共患的传染病。多杀性巴氏杆菌分布广，常以带菌状态寄生于家兔的呼吸道粘膜及扁桃体，兔的带菌率为35%～70%。该病在各种年龄阶段的兔中均有发生，更易感染幼龄或体质虚弱的家兔。该病一年四季均可发生,特别是在气温骤变、潮湿、闷热、通风不良饲养管理不当等不良应激情况下最易发生。如遇急性暴发可造成兔群的大批死亡。慢性感染则会由于难以根治造成疫情缠绵不断，时常发生，损失严重。

2017年8 月，保定市某县农户饲养1000多只獭兔，发病兔50只，死亡13只。通过流行病学调查、临床症状、剖检特征、实验室诊断、确诊为多杀性巴氏杆菌感染。现将具体情况报告如下：

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

普通营养培养基、血琼脂培养基、麦康凯培养基本实验室提供

1.2 试验方法

1.2.1 临床症状 病兔表现为精神沉郁、食欲减退、体温升高，眼结膜发红，流出浆液性分泌物。并且不停的甩鼻、打喷嚏，从鼻孔中不断流出浆液性或黏液脓性分泌物，在鼻孔外周结痂。由于病兔常用前爪去抓鼻子，使鼻孔外面的被毛凌乱、脱落。个别兔拉稀粪或白色粘液便。病情严重的逐渐衰弱消瘦造成生长停止或死亡。

1.2.2 病理变化 各浆膜、粘膜、脏器有大小不等的出血点，气管和鼻腔充血、水肿，有黏液性或脓性分泌物；胸腔积液，胸膜、肺、心包膜上有纤维素絮片；肺脏、肝脏、脾脏有不同程度的水肿、出血，肾脏有出血点；胃肠粘膜充血、出血。

1.2.3 细菌的分离、筛选、纯化 无菌取病死兔的肝脏、脾脏和鼻、咽棉拭子，接种营养琼脂、血琼脂培养基，分别在有氧和无氧条件下培养，经37℃培养24～48h后取可疑菌落划线于血琼脂培养基和麦康凯培养基，37℃培养24～48h后取可疑菌落抹片、革兰氏染色镜检。

1.2.4 分离菌的鉴定

1.2.4.1 革兰氏染色 将分离的可疑菌落进行涂片，分别进行革兰氏染色和运动力检查。

1.2.4.2 细菌三糖铁试验 将典型可疑菌落接种于三糖铁琼脂斜面，37℃培养24h观察颜色变化。

1.2.4.3 菌落PCR特征鉴定 用1mL分离纯化并过夜培养的细菌菌液，用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行基因组DNA提取（购于生工生物工程（上海）有限公司），根据设计的细菌鉴定通用引物（见表1）及相应的PCR操作程序，对初步鉴定的细菌进行PCR扩增。收集扩增后的产物，进行测序，并通过基因Bank的BLAST进行比对、鉴定。

表1 菌种鉴定通用引物

1.3 结 果

1.3.1 分离菌的分离鉴定 分离菌无论在有氧或无氧的条件下均可以生长，说明此菌为需氧及兼性厌氧菌。在各种培养基上的表现为：营养琼脂有菌落生长，呈灰白色、半透明、露珠样小菌落，表面光滑，边缘整齐；在血琼脂平板上长成周围不溶血、水滴样和湿润小菌落；接种于麦康凯培养基上不生长，镜检为革兰氏阴性菌（如图1）。基本符合多杀性巴氏杆菌的基本特征。

图1 菌落形态

1.3.2 分离菌的染色 革兰氏染色可见到两端钝圆、中央微凸的球杆菌。不形成芽孢，无鞭毛，不运动，有荚膜，呈两极着色的革兰氏阴性菌。

1.3.3 三糖铁试验 三糖铁试验结果：斜面培养基变黄，底层变黄，产酸不产气。

1.3.4 PCR扩增及测序鉴定结果 对分离到的疑似菌株进行PCR扩增，在1500bp处得到有一条特异性条带。收集扩增产物，进行测序并通过BLAST进行比对，鉴定结果为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida subsp.septica）。（见图2、3）

1.4 小结与讨论

1.4.1 根据发病情况、临床症状、剖检变化，细菌培养、三糖铁检测及菌落PCR鉴定，确诊本病为由兔巴氏杆菌引起的疾病。

（图2）细菌DNA ITS扩增产物大小在1500bp左右

1.4.2 结果显示，该菌株具有较强的致病性，属于条件致病菌。发病动物和带菌动物是本病的主要传染源。当饲养条件不佳、气候环境剧变、通风不良、营养不佳、应激因素和寄生虫的侵害等诱因作用下，使其抗病力下降时，易感染发病。因此，该病应以预防为主，治疗为辅的防制措施。加强饲养管理，根据当地本病的流行情况和养殖场实际情况，制定本场的免疫程序，增强兔的特异性免疫力。

图3 测序结果和比对结果