淋病奈瑟菌耐药外排泵研究进展

周 可 陈绍椿 尹跃平

淋病(gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)所致的泌尿生殖系统化脓性炎性疾病。目前，淋病仍是全球最常见性传播疾病，仅在2012年全球新发病例78,000,000例[1]。中国每年报告约11.5万例新发淋病病例，最新调查结果表明，2013-2016年期间，阿奇霉素耐药和头孢曲松耐药的比例都有所增加，较日本略低，明显高于美洲和欧洲等国家的报道[2]。抗生素是淋病治疗的唯一有效手段，由于抗生素的广泛使用，淋球菌对抗生素的耐药明显增加，给防治和控制本病带来严重困难。在奈瑟菌属，目前已有研究的4个外排泵系统分别为：MtrCDE、MacAB、NorM和FarAB。其中MtrCDE，MacAB，NorM和FarAB系统分别属于耐药节结化细胞分化家族(resistance/nodulation/cell division family，RND)、ATP结合盒超家族(ATP-binding cassette superfamily ABC)、多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)和主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MF)。此外一些菌株还发现MtrF以及一种由mef编码的泵蛋白。淋病奈瑟菌的MtrCDE可以排出不同的疏水性抗菌药物，如青霉素、广谱头孢菌素、环丙沙星和四环素、胆盐、阳离子抗菌肽；MacAB与淋球菌对青霉素G的敏感性增加有关；同时MtrCDE和FarAB也会参与排出内源性抗菌剂，包括阳离子抗菌肽和长链脂肪酸。对于这几种泵的研究逐渐深入，对于有关淋球菌流行病学研究，淋球菌发病机制以及新药开发均有一定作用。下面对几种外排泵的结构、功能、调控及突变对淋球菌多重耐药的影响分别进行介绍。

1 MtrCDE-MtrR

淋球菌主要侵犯黏膜表面，这些部位通常被含有脂溶性因子(hydrophobic agents, HAs)如:毒性脂酸、胆盐等的黏液覆盖。早在1978年，Sparling即在HAs抵抗的分子机制尚不清楚的情况下，发现mtr(multiple transferable resistance)系统，即多重可传递耐药系统，它的存在可以帮助淋球菌抵抗粪便中脂类及胆盐的毒性而生存于特定器官的黏膜表面。淋球菌对HAs耐受性是因为菌体细胞能把HAs其有效地排出细胞体外[3]。mtr作为一个以质子运动提供能量的能量依赖型外排泵，与其它一些细菌的外排系统类似，如绿脓杆菌的mexAB-oprM系统、大肠杆菌的acrAB 和 acrEF-TolC系统等[4]。完整的淋球菌mtr外排系统是一个多重可传递耐药操纵子，包括mtrR调控基因及mtrCDE基因复合物,其中mtrC、mtrD、mtrE三者的开放阅框呈串联排列形成一共转录体即mtrCDE[5]。下面分别介绍mtrCDE，mtrR的结构功能及调控系统。

1.1 mtrCDE-mtrR的编码基因及结构功能 mtrC为膜融合蛋白类辅助蛋白，mtrD为外排蛋白，mtrE为外膜通道蛋白。mtrC使位于细胞膜的mtrD与外膜的mtrE相连接，依赖质子耦联交换产生的质子驱动力将胞内及胞间隙的底物泵出细菌。mtrR为调控基因编码阻遏蛋白，抑制mtrCDE的外排功能。

1.1.1 mtrC mtrC基因由1239 bp组成，编码大小44kDa的膜蛋白，位于细胞周质间隙归属于MFPs家族，其编码蛋白与大肠杆菌的McrA及EnvC蛋白、绿脓杆菌的MexA蛋白有同源性。编码该蛋白的基因受位于上游250 bp处的mtrR表达调控，同时mtrC内若含有4 bp的缺失(349-GCGC-352)，将在mtrC基因链上产生一个新的终止密码，而生成面目全非的mtrC蛋白，从而影响mtr外排泵系统的完整性[6,7]。

1.1.2 mtrD mtrD基因由3204 bp组成，是mtr系统中最大的，起始密码子依次位于mtrC终止密码子下游12 bp处，编码大小33KDa膜蛋白，其包括14个螺旋结构和两个环形结构，位于细胞质膜。该蛋白与大肠杆菌的AcrE蛋白和绿脓杆菌的MexB蛋白同源，同属于RND家族成员，为能量依赖型蛋白运输抗生素及细菌产物至菌体细胞外液。mtrD带有一个56个氨基酸的信号肽可能对淋球菌细胞内HAs的浓度变化敏感，并将信号传递给mtrD[8,9]。

1.1.3 mtrE mtrE基因位于mtrD终止密码TAA的52bp下游，由1404bp组成，编码48.3KDa膜蛋白，属外膜外排蛋白，与绿脓杆菌OprM蛋白和大肠杆菌TolC蛋白功能一致。其部分基因序列与绿脓杆菌的oprM基因有36.2%的同源性[10,11]。mtrE是一种由三个结构域组成的同质三聚体：一个嵌入在外膜中的β桶结构域，一个α桶结构域，将100多个结构域投射到细胞质周围，以及一个位于α桶中间的赤道结构域。到目前为止，mtrE是唯一在结构上确定显示开放构象的RND家族外膜通道蛋白[12]。有学者通过全原子分子动力学模拟分析发现，膜融合蛋白MtrC与膜外表面的结合能稳定通道的开放状态，因此发现MtrCDE的外膜通道蛋白和膜融合蛋白之间的接触区域可帮助外部药物流出管道开放和封闭状态之间的转换，这个界面可能是一个潜在的干预位点[13]。

1.1.4 mtrR mtrR基因位于mtrC基因的上游，由633bp组成，是外排系统最小的基因，编码蛋白分子量为23KDa，由210个氨基酸组成。MtrR蛋白作为QacR/TetR家族成员，尤其与四环素抑制子家族、LuXR转录活化子具有同源性。结合于mtrCDE基因启动子区域对mtr系统的转录起负调控作用[14]。

1.2 mtr系统的调控 目前已知mtr系统对淋球菌多重耐药在基因水平上有两种调控机制，分别为mtrR依赖调节机制和非mtrR依赖调节机制。前者由于mtrRCDE基因复合物中mtrR基因有缺失或突变引起；后者是mtrR启动区的13 bp插入一重复序列，这个序列是一个反转控制序列，它位于mtrR和mtrC基因(-10～-35)之间，此序列中的一对碱基缺失，对mtrR和mtrC基因的表达有相反的作用，使mtrR基因表达减少，mtrC基因表达增加，从而使淋球菌对HAs的耐受性增加。由于mtrR基因编码转录抑制蛋白，mtrR基因的突变导致外排泵抑制作用减弱或消失，使mtrR基因下游的mtrCDE基因转录开放，细胞膜中的mtrCDE蛋白增多。过多的mtrCDE蛋白使外排系统功能增强，故增加了对多种不利于淋球菌生长的物质的抵抗力[15]。此外，在mtrR启动区13 bp重复序列2个碱基TT的插入，直接导致86位氨基酸Thr转变成Ala以及105位氨基酸His转变成Tyr，从而导致淋球菌对红霉素及阿奇霉素敏感性降低或产生耐药[16]。为了定义由mtrR调控的基因，采用微阵列技术对MtrR阳性和MtrR阴性淋球菌的中对数期发酵液中提取的总RNA进行分析，发现mtrR可以直接或间接地调节69个基因，其中被抑制基因(包含mtrCDE操纵子)有47个，被激活基因有22个。其中一种被抑制的基因是rpoH，它编码了另一种应激反应sigma因子 (sigma 32)，这似乎是淋球菌在温度升高条件下具备生存能力的必要条件。除了对mtrCDE的调节和对疏水性抗菌药物的淋球菌的耐药水平外，mtrR对rpoH表达的调节可能对体内的淋球菌生存有重要意义，即mtrR可能调节淋球菌抵抗机体固有防御系统中性粒细胞的氧化和非氧化杀伤系统发挥一定作用。同时还发现淋球菌基因hsp33受mtrR的管制，前者编码的Hsp33在淋球菌中可能与对温度升高及过氧化物的反应有关，与grpE不同的是mtrR对hsp33的抑制可能是直接的，两者结合点由31个bp组成，从核苷酸110到141。对于淋球菌来说，mtrR表达似乎是一个劣势，因为它的存在会降低对排出抗生素药物所需要基因的表达。但同时淋球菌mtrR也可以转录激活某些涉及新陈代谢基因，例如:abpE、glnE和rfbB，来帮助淋球菌在机体中生存[17]。Shafer研究小组对FA1090株全基因组序列分析发现一个开放的阅读框架(NGO 1360)，位于mtrCDE操作子下游的943 bp。GdhR属于细菌的GntR蛋白家族，它是基因调节因子，含有高度保守的N端DNA结合区和一个参与效应结合及低聚反应的可变C端结构域。鉴于gdhR靠近mtr位点，研究者鉴于mtrR在调节淋球菌对抗菌药物的耐药性中的重要作用、对代谢相关基因的调控、对实验感染模型中淋球菌适应度的影响以及与gdhr的接近性，假设gdhR和mtrR分别对mtr和gdh基因位点具有交叉调节作用，经过验证并未发现GdhR调控mtrCDE或抗菌耐药性的证据，但实验中发现缺失GdhR的菌株在感染雌性小鼠下生殖道时的体内适应性明显提高[18]。在对淋球菌耐药机制研究中发现，mtr系统所发挥作用显而易见，从生态学角度来看，淋球菌外排系统可为其在不利的生存环境中提供一个生存优势。

2 MacAB外排泵

在2001年发现大肠杆菌有一种可以识别大环内酯类抗生素的ATP转运蛋白，并将其命名为MacAB[19]。有研究通过对淋球菌FA1090基因序列的分析，发现两种开放的阅读框架(ORFs)即macA，macB编码两种蛋白，与大肠杆菌MacA，MacB分别具有35.1%、51.1%的同源性。MacA属于MFP家族，MacB是一种具有ATP结合域的完整膜蛋白质。Corinne E等发现在位于macA基因ATG的上游37 bp处有一个C核苷酸的转录起始点，在这个转录起始点上游有7个碱基对是一个假设启动子，接近-10序列(TAGAAT)和-35序列(TTGGAT)间。-10的hexamer序列中的G核苷酸是在淋病和脑膜炎球菌序列上的macAB启动子序列的特征，对macAB的转录有抑制作用。为证明对于淋球菌除了Mtr外排系统，还有MacAB参与大环内酯类抗生素的耐药，使用操纵子插入突变及启动子错义突变法加强MacAB的表达后可以增强对大环内酯类抗生素的耐药，作者推测MacAB具有识别大环内酯的能力，然而，其对大环内酯类淋球菌耐药性的贡献被MtrCDE泵的存在所掩盖，对于一些含有对mfc基因或rRNA甲基化酶基因的菌株来说也可能是如此，后者提供了比MtrCDE泵更高的大环内酯抗性水平[20]。

3 FarAB

FarAB(fatty acid resistance)是在男男性接触者淋病患者直肠感染灶中分离出的菌株上发现，这些菌株表现对具有潜在抗菌活性的长链脂肪酸如亚麻脂酸、棕榈脂酸、油脂酸等的抵抗，但这些菌株并不一定对脂溶性抗生素耐药，在之前研究中淋球菌对脂溶性抗生素耐药是由mtr外排系统导致的，因此推测淋球菌还有一种外排系统。1999年Ham等首先克隆并鉴定了另外一种外排系统FarAB，并证明淋球菌对上述长链脂肪酸耐药是由该系统导致的。FarAB外排系统是由淋球菌染色体DNA编码的基因组，包括两个串联的开放阅读框farA和farB。farA为一个含有394个氨基酸残基的蛋白,在氨基酸序列上，farA与大肠杆菌的EmrA和霍乱弧菌的VceA均为MFPs家族成员，但与同源蛋白相比，farA蛋白的N末端缺失一段信号肽片段，farA位于淋球菌细胞壁间质中，作为间质外排蛋白而发挥其功能。farB与大肠杆菌EmrB和霍乱弧菌的VceB分别有57.7%和38.7%的同源性，上述三种蛋白也同属于MF家族。farB亦为一胞膜主要蛋白，结构分析显示farB的氨基酸序列包含14 个跨膜螺旋，farB的作用底物通常是一些长链脂肪酸。Far外排系统缺乏一个与其共转录的外膜外排蛋白，研究发现，mtrE失活时 farAB导致的抗脂酸活性丧失，因此确定mtrE作为farAB外排系统的外膜通道蛋白，形成一贯穿细菌膜壁的外排通道结构即farA-farB-MtrE发挥外排作用[21]。

虽然farAB系统与大肠杆菌的emrAB同源，emrAB基因上游存在一个调控基因emrR，该基因编码一种转录调控蛋白EmrR调节emrAB的转录，但在farAB上游并不存在这一类似序列，在farAB系统存在着属于MarR家族的转录阻遏蛋白FarR，其可以负调控FarAB蛋白的表达。Shafer等发现farAB系统仍需MtrE外膜通道蛋白的协助对抗生素起作用，其呈串联连接的两基因farA和farB的表达似乎与mtrR蛋白的水平呈正相关，而mtrR蛋白通常被认为是mtr系统的转录抑制子，而且farAB上游启动子区内包含一段类似于mtrR特异结合位点的序列，这些似乎说明farAB系统受到mtrR蛋白的直接性正性调节，随后的试验证实，mtrR并不能特异的结合到这一序列上，但它可负调节FarR蛋白的表达而间接上调fabAB的表达[22]。

4 NorM外排泵

Shafer等在发现淋球菌拥有两种外排泵后，即属于RND家族的mtr外排泵系统和属于MF家族的FarA-FarB外排泵系统，又发现淋病奈瑟菌及脑膜炎奈瑟菌上存在另一种外排转运蛋白，因其与副溶血性弧菌的NorM同源，因此称之为NorM。通过分析发现NorM蛋白可以增加一些没有被mtrCDE和FarAB所识别的一些化合物，例如：溴化乙锭(EB)、盐酸吖啶黄(AFh)、2-N-methylellipticinium (NME)和黄连素(BE)。并且发现NorM基因上游的一个点突变可以导致其过度表达，从而降低奈瑟菌对诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)和苯甲氯铵(BC)的敏感性[23]。

NorM在淋球菌细胞膜是以Na+作为能量来源，Lu等认为，Na+通过诱导蛋白质构象变化而触发多种药物的挤压，而不是直接竞争底物结合的氨基酸。与其他多药转运蛋白如：p-糖蛋白(ABC家族)和EmrE(SMR家族)相比较，这些多药转运蛋白使用大量的疏水化合物，特别是芳香氨基酸将底物固定在一个相对大的疏水腔内，而淋球菌的NorM是用少量的疏水残留物用于药物底物的结合。此外，至少有3个酸性残余物被用来抵消底物，这可能是阻止通过蛋白质的结合和运输所必需的负电荷或电子合成物，从而赋予了底物的特异性[24]。

5 MtrF AbgT

淋球菌外排泵系统的另一个内在膜蛋白MtrF，属于AbgT的转运蛋白家族。已经发现MtrF与mtrCDE结合，通过一种未知的机制来排出某些抗菌药物。在革兰氏阴性细菌如沙门氏菌、革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等以及酵母等酵母均可发现AbgT蛋白。研究者最初在mtrR基因的下游定位mtrF，它被预测编码56.1 kDa的细胞质膜蛋白质，包含12个跨膜域。大肠杆菌AbgT蛋白已被证明能催化叶酸分解代谢物-氨基苯甲胺-谷氨酸盐的吸收和分解，并可以从分解叶酸的合成中导入分解代谢物氨基苯甲酰亚胺。因此推测淋球菌MtrF蛋白也有可能作为一个输入通道，吸收对氨基苯甲酸盐和相关的小分子合成基本的叶酸。MtrF的外排作用也体现从细胞中清除磺胺类抗生素，并调节细菌对这类抗生素的耐药性[25，26]。

MtrF是一种522种氨基酸的晶体结构，其不对称的单元包含两个MtrF分子，以二聚物的形式聚集在一起。MtrF二聚体晶体结构表现为一个碗状凹形结构。MtrF的每个子单元由9个螺旋形的跨膜段和两个螺旋发夹组成。有研究者推测MtrF可能是一种能识别和挤压磺胺类代谢物的药物泵，能量来源于质子驱动。有研究已经确定影响mtrF表达的两个抑制因子，即MtrR和MpeR。在缺乏MtrR和MpeR的菌株中，mtrF的表达比单一突变出现时增强。MtrR和MpeR对mtrF的抑制是附加的，与 MtrR对mtrF表达的抑制是分别独立存在的。mpeR基因被限制为具有致病性淋球菌特有的，并受到淋球菌铁转运过程中的铁吸收调节剂和铁的负性调节。Hollander等发现MpeR直接激活菌株的fetA基因，后者编码的FetA是一种表面暴露的肠类星状铁体的受体，是一种由淋球菌所使用的受体复合体的外膜转运体，以获得由其他细菌产生的铁。FetA也在脑膜炎奈瑟菌中存在，并具有免疫原性，从脑膜炎球菌病患者的康复期血清中出现抗fetA抗体与淋球菌有交叉反应[27-29]。

6 MtrA AraC

Rouquette等[30]报道了另一种调控基因MtrA，其编码的蛋白MtrA属于Arac/Xy1转录活化子家族,此调控蛋白可上调mtrCDE的表达,这样Mtr系统就同时受到MtrA和MtrR的正负双重调。这些表型典型的HAs敏感的淋球菌可以使用一种依赖于MtrA依赖性的途径来增强其在感染过程中遇到的阻力。在进入其他有缺陷的位点后，通过MtrR转录抑制因子的作用，可以逆转由外泵蛋白的过度表达所产生的负生长影响[30，31]。针对922株淋球菌测序发现野生型的MtrA存在稳定，并且多数菌株可能通过MtrCDE显示诱导抗菌素耐药性的能力[32]。

H041转化株菌株缺失MtrCDE泵显示对青霉素、头孢曲松钠、阿奇霉素、四环素、索利霉素敏感度显著增加。将H041继续转化缺失MacAB的H041变异株分别增加了4倍和2倍的阿奇霉素和头孢菌素的敏感性，而H041转化成缺失NorM的变异株索利霉素敏感性增加32倍。与只缺少MtrCDE泵的突变体相比，多泵的损失并没有显著增加易感性[33]。

综上所述，淋球菌外排系统涉及多种家族蛋白，其外排因素造成耐药的原因复杂，可以单一外排泵作用也可能多种联合作用，互相之间关联与调控值得进一步探究。目前临床尚未有针对淋球菌外排泵抑制剂的药物。因此，针对淋球菌外排泵所开发的相应抑制剂对于淋球菌感染的治疗而言有着深远的意义。