御唐丸对糖尿病大鼠胰腺组织IRS—1基因表达和蛋白磷酸化的影响

郑南 谢宁 张佩青 高丽娟

[摘要] 目的 探討御唐丸对糖尿病大鼠胰腺组织胰岛素受体底物-1（IRS-1）基因表达和蛋白磷酸化的影响。 方法 将150只SD大鼠按体重分层随机分为空白组（20只）及造模组（130只）。用高脂饲料连续喂养造模组大鼠10周制备2型糖尿病大鼠模型，按随机数字表法分为模型组、糖尿乐组、御唐丸高剂量组、御唐丸低剂量组及格华止组，每组20只。按大鼠与成人等效剂量折算，御唐丸高剂量组给予御唐丸2.70 g/（kg·d），御唐丸低剂量组给予御唐丸1.35 g/（kg·d），糖尿乐组给予糖尿乐2.43 g/（kg·d），格华止组给予格华止0.09 g/（kg·d），模型组及空白组给予生理盐水2 mL/d。连续灌胃给药8周后取大鼠胰腺组织，用Real-time PCR方法检测IRS-1 mRNA表达水平，用Western blot法检测IRS-1蛋白表达及磷酸化水平。 结果 与模型组比较，格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量均有所增加（P < 0.05或P < 0.01），且御唐丸高剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量高于御唐丸低剂量组（P < 0.05）；与模型组比较，格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组IRS-1 ser307蛋白磷酸化水平均显著降低（P < 0.01），且御唐丸高剂量组IRS-1 ser307蛋白磷酸化水平显著低于御唐丸低剂量组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 御唐丸能通过影响IRS-1 mRNA相对表达量、抑制IRS-1 ser307蛋白磷酸化进程从而减轻胰岛素抵抗，进而对2型糖尿病起到治疗作用。

[关键词] 2型糖尿病；健脾益肾；养气补阴；胰岛素受体底物-1

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（c）-0011-05

[Abstract] Objective To study the effects of Yutang Pills on gene expression of insulin receptor substrate-1 （IRS-1） and protein phosphorylation in pancreatic tissue of diabetic rats. Methods In this study， 150 SD rats were randomly divided into two groups according to their weight， with 20 rats in the blank group and 130 rats in the model group. The model group was fed with high fat forage for 10 weeks to prepare type 2 diabetic rat models and then divided into model control group， Tangniaole group， high dosage of Yutang Pills group， low dosage of Yutang Pills group and Glucophage group according to random number table method， with 20 rats in each group. With the equivalent dosage of rats and adults， the high dosage of Yutang Pills group was given 2.70 g/（kg·d） of Yutang Pills， low dosage of Yutang Pills group was given 1.35 g/（kg·d） of Yutang Pills， Tangniaole group was given 2.43 g/（kg·d） of Tangniaole， and Glucophage group was given 0.09 g/（kg·d） of Glucophage， meanwhile， the model control group and the blank group were given 2 mL/d of normal saline. The pancreatic tissues of rats were taken after 8 weeks of continuous intragastric administration， IRS-1 mRNA expression level was detected by Real-time PCR， and IRS-1 protein expression and phosphorylation levels were detected by Western blot. Results Compared with the model control group， the relative expression of IRS-1 mRNA in Glucophage group， Tangniaole group， low dosage of Yutang Pills group and high dosage of Yutang Pills group was increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the relative expression of IRS-1 mRNA in high dosage of Yutang Pills group was higher than that in low dosage of Yutang Pills group （P < 0.05）. Compared with the model control group， the levels of IRS-1 ser307 protein phosphorylation in Glucophage group， Tangniaole group， low dosage of Yutang Pills group and high dosage of Yutang Pills group were significantly decreased （P < 0.01）， and the level of IRS-1 ser307 protein phosphorylation in high dosage of Yutang Pills group was lower than that in low dosage of Yutang Pills group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Yutang Pills can play a therapeutic role in type 2 diabetes mellitus by affecting the relative expression of IRS-1 mRNA and inhibiting the progress of ser307 protein phosphorylation on IRS-1 to reduce insulin resistance.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus； Strengthening spleen and supplementing kidney； Supplementing qi and nourishing yin； Insulin receptor substrate-1

糖尿病（DM）是在遗传因素和环境因素长期相互作用下导致的一种慢性、全身性、代谢性疾病，对人类健康的危害很大。DM的分型绝大多数为2型DM（T2DM），占总数的95%左右[1]。西医研制的胰岛素增敏剂、α-糖苷酶抑制剂、双胍类及磺脲类等降糖药虽疗效肯定，但普遍存在抗药性、胃肠道反应及肝肾毒性等副作用。中医药对于DM的发病机制和防治有着自己独到的见解，其持久有效、副作用小的临床效果已受到广大DM患者的普遍认可[2-5]。现代中医学者通过探索研究，相继提出了脾胃亏虚、精气不足、肝肾郁结等DM致病理论，为DM的中医治疗和预防指出了新的方向[6-9]。御唐丸是谢宁教授以民间验方为基础，针对T2DM中医病机特点，结合历代名医治疗消渴病的宝贵经验和大量的珍贵文献，遵循健脾补肾、益气养阴法拟定而成的纯中药复方制剂。大量实验已证实御唐丸具有良好的降血糖和改善胰岛素抵抗的作用。本研究通过动物实验探讨御唐丸是否能通过对胰岛素受体底物-1（IRS-1）基因表达和蛋白磷酸化的影响来治疗T2DM。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠150只，8周龄，体重（180±20）g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK（黑）2017-012。

1.2 实验药物

御唐丸由西洋参、山药、麦冬、葛根、黄芪、白芍、玉竹、山萸肉、乌梅、龟板、鹿茸、女贞子等组成，黑龙江省中西医结合研究所制剂室生产（批号：20170520）。

糖尿乐：每片0.31 g，郑州韩都药业集团有限公司生产（批号：171103-2）。

格华止：盐酸二甲双胍片，每片0.85 g，中美上海施贵宝制药有限公司生产（批号：V4717）。

1.3 仪器与试剂

主要试剂：大鼠胰岛素酶免试剂盒（FINS）（中生北控生物科技股份有限公司，批号：YZB，京0812-2017）；IRS-1[IRS-1（59G8）Rabbit mAb #2390，美國CST公司，批号：2017-3]；P-IRS-1 ser307[Phospho-IRS-1（Ser307）Antibody #2381，美国CST公司，批号：2017-8]。

主要仪器：F50酶标仪（上海迪奥生物科技有限公司）；721型可见光分光光度计（山东高密分析仪器厂）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SYBR Real-time PCR Universal Reagent（上海艾博思生物科技有限公司）；MX3000P Real-time PCR Instrument（美国stratagene公司）；Kodak X-Omat BT Film（Kodak中国股份有限公司）。

1.4 模型制备

150只大鼠适应性饲养1周，造模前测定血糖，剔除血糖异常的大鼠。按照体重分层随机分为空白组（20只）和造模组（130只）。空白组与造模组大鼠均采取自由饮食，空白组以基础饲料喂养，造模组以高脂饲料喂养。连续喂养10周后，禁食水12 h，造模组腹腔一次性注射1%链脲佐菌素溶液30 mg/kg，空白组腹腔注射2 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后每天尾静脉采血测大鼠空腹血糖，持续1周以上空腹血糖维持在≥16.7 mmol/L者为T2DM成模大鼠。成功复制模型大鼠102只。

1.5 分组及给药

选取100只成模大鼠按随机数字表法分为模型组、糖尿乐组、御唐丸高剂量组、御唐丸低剂量组及格华止组，每组20只。未经造模处理的20只大鼠作为空白组，各组大鼠组内进行标记。

按照大鼠与成人等效剂量折算，御唐丸高剂量组给予御唐丸2.70 g/（kg·d），御唐丸低剂量组给予御唐丸1.35 g/（kg·d），糖尿乐组给予糖尿乐2.43 g/（kg·d），格华止组给予格华止0.09 g/（kg·d），模型组及空白组给予生理盐水2 mL/d。连续灌胃给药8周后，全部处死、取样。

1.6 标本的采集

末次给药后禁食水12 h，通过眼球取血获得血样，室温静置1 h后，3000 r/min 4℃离心10 min获得血清（有效离心半径为14 cm），送至-80℃冰箱中冷冻备用。解剖大鼠，将胰腺经锡纸包裹后立即置于液氮，再转至-80℃冰箱低温冻存，用于IRS-1的PCR和Western blot检测。

1.7 各指标检测方法

1.7.1 空腹血糖（FBG） 每2周周末大鼠禁食12 h后于尾静脉取血，采用Contour TS拜安康血糖仪测定，同时记录大鼠即时体重，比较本次血糖与前次血糖的变化。

1.7.2 空腹血清胰岛素（FINS） 取定量血清，釆用酶标仪检测，根据试剂盒操作说明进行测定。

1.7.3 胰岛素抵抗指数（HOMA-IR） HOMA-IR=（FINS×FBG）/22.5，FBG的单位是mmol/L，FINS的单位是mmol/L。HOMA-IR不符合正态分布可取自然对数，正常值是1。由于胰岛β细胞与肝脏间具有反馈环路，血清胰岛素与血糖的平衡关系是合成并分泌胰岛素与肝糖原分解成葡萄糖达到平衡的反映，这是HOMA的原理[10]。

1.7.4 Real-time PCR方法检测IRS-1 mRNA表达水平 设计IRS-1的引物序列，其上游引物为5′-CGGGCTTAGGTCAGACAGC-3′，下游引物为5′-TCA-CAGCTGATGGTCTTGCTG-3′。反应条件：95℃ 3 min，94℃ 20 s，62℃ 40 s，40个循环。Real-time PCR所有数据均采用2-△△Ct法计算。

1.7.5 Western blot法检测胰腺组织中IRS-1蛋白表达及磷酸化水平 组织细胞样本中加入300 μL裂解液进行裂解，取10 μL样本加入10 μL 2×SDS-PAGE loading buffer混勻，100℃加热5 min，冰上冷却，12 000 r/min离心5 min，去除沉淀，10% SDS-PAGE分离，Semi-Dry Cell进行半干电泳转移，Blocking Buffer封闭转印膜4℃过夜，37℃温育洗涤，Super-GL ECL超敏发光液进行化学发光检测，X线片曝光定影，Gel-Pro Analyzer软件分析处理蛋白表达及磷酸化水平。

1.8 统计学方法

数据统计学处理用SPSS 17.0软件完成。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用方差分析，两两比较应用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平比较

与空白组比较，模型组大鼠的FBG、FINS及HOMA-IR水平显著增高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组大鼠的FBG、FINS及HOMA-IR水平均有所下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；御唐丸高剂量组大鼠的FINS水平显著低于御唐丸低剂量组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠胰腺组织IRS-1 mRNA表达水平比较

与空白组比较，模型组IRS-1 mRNA的相对表达量显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量均有所增加（P < 0.05或P < 0.01）；御唐丸高剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量高于御唐丸低剂量组（P < 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠胰腺组织P-IRS-1 ser307蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组P-IRS-1 ser307蛋白水平显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组大鼠胰腺组织中P-IRS-1 ser307蛋白水平均显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；御唐丸高剂量组P-IRS-1 ser307蛋白水平显著低于御唐丸低剂量组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3、图1。

3 讨论

DM是一种内分泌代谢紊乱性疾病，其典型特征为慢性持续性的血糖浓度增高、糖耐量异常以及尿糖阳性。人体血糖浓度增高的主要原因是机体内胰岛β细胞合成并分泌胰岛素或胰岛素在机体内被利用的过程发生障碍[11]。胰岛素可通过两条途径发挥其降血糖的功效：一是减少血糖的来源，即抑制葡萄糖生成的过程，减少氨基酸、乳酸及甘油向糖原进行转化，减少肝糖原的分解，抑制糖原异生；二是增加血糖的去路，即促进葡萄糖在体内的利用，促进肌糖原及肝糖原的合成及贮存，同时促进葡萄糖从胞外向胞内转运。由此可见，胰岛素在体内作用强度减弱后血糖的浓度势必增高[12]。同时，胰岛素的合成和分泌受血糖浓度的调节，长期过多地摄入能量将会导致血糖浓度持续升高，这会使胰岛素的受体后存在缺陷，并且功能状态受损，减弱胰岛素在脂肪、肌肉及肝脏组织靶细胞及靶组织中发挥的功能[13]。研究表明，胰岛素信号在转导过程中出现异常是导致胰岛素抵抗出现的重要原因，胰岛素受体以及受体后存在缺陷均可导致胰岛素的信号在转导过程中出现异常[14]。

IRS-1广泛分布于全身各个组织，是胰岛素抵抗的候选基因，其含有的蛋白质的调节功能能够促进胰岛素的信号转导。IRS-1 mRNA的表达量降低可使胰岛素的信号转导水平下降，因此，IRS-1 mRNA表达的相关缺陷可抑制蛋白质的功能发挥，进而造成胰岛素信号在转导过程中出现异常，从而诱发T2DM发病[15]。IRS-1中含有的酪氨酸残基在经过磷酸化之后，IRS-1就具有锚定的功能，锚定诸多接连的分子或诸多位于下游的在结构组成上含SH2区域的酶，从而对胰岛素信号在细胞内进行转导起到介导的作用[16-18]。实验研究表明，IRS-1基因彻底断裂的小鼠，不但在胚胎期以及出生之后均会出现生长发育缓慢的现象，且会出现明显的胰岛素抵抗症状[19-20]。除此之外，相关研究表明，JNK信号通路处于激活状态，能够促进IRS-1上丝氨酸进行磷酸化，降低胰岛素受体上的酪氨酸激酶活性，进而抑制IRS-1上的酪氨酸位点进行磷酸化，该反应具有级联性，JNK信号通路是否被激活与胰岛素信号通过级联反应在体内进行信号转导密切相关[21]。IRS-1及IR蛋白均为胰岛素信号在体内进行转导的主要分子，因此IRS-1蛋白表达量和功能状态在确保胰岛素正常功能发挥中起到至关重要的作用。

实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠的FBG明显升高，并存在一定程度的胰岛素抵抗。治疗后，与模型组比较，御唐丸高剂量组、御唐丸低剂量组大鼠的FBG、FINS及HOMA-IR水平均明显降低。同时，与模型组比较，御唐丸高剂量组、御唐丸低剂量组大鼠胰腺组织的IRS-1 mRNA表达水平明显升高，P-IRS-1 ser307蛋白表达水平明显下降，说明御唐丸能够上调IRS-1 mRNA相对表达量，降低P-IRS-1 ser307表达量，提示御唐丸能够通过促进胰岛素与其受体结合提高IRS-1 mRNA表达，抑制IRS-1上ser307磷酸化进程，阻碍位于上游的JNK蛋白磷酸化过程，从而减轻胰岛素抵抗，对T2DM起到治疗作用。

综上所述，本研究通过对IRS-1基因的表达和蛋白磷酸化的研究，提示御唐丸能够促进精微物质在体内的消化吸收，增强体内胰岛素的靶细胞、靶组织对胰岛素的敏感性，能够在减少血糖的来源的同时增加血糖的去路，从而降低血糖浓度，纠正糖代谢的紊乱状况。由此可推断，御唐丸能够使血糖浓度降低的机制与其抑制IRS-1上丝氨酸进行磷酸化具有相关性。

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（收稿日期：2018-05-08 本文编辑：张瑜杰）