茵陈蒿汤联合加味大柴胡汤对肝缺血再灌注损伤大鼠的影响

张北平 翟淑萍 苑伟 颜勇 章小兵 王百林

[摘要] 目的 观察茵陈蒿汤联合加味大柴胡汤对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 将肝脏缺血再灌注模型大鼠按照随机数字表法随机分为缺血再灌注中药组（TCM组，n = 75）、缺血再灌注对照组（Control组，n = 75）和假手术组（Sham组，n = 75）。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法和Western blot法分别检测大鼠血清中白细胞介素-1（IL-1）和肝匀浆组织中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及核转录因子-κB（NF-κB）的含量。 结果 三组大鼠缺血再灌注后，随着时间的延长，血清IL-1含量逐渐升高，在缺血再灌注后相同时间内，TCM组血清IL-1含量均低于Control组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。随着时间的延长，TCM组及Control组大鼠术后肝匀浆组织NF-κB及ICAM-1的表达逐渐增多，且TCM组各时间点NF-κB和ICAM-1的表达均低于对照组（P < 0.05）。结论 茵陈蒿汤联合加味大柴胡汤可明显减轻大鼠肝缺血再灌注的损伤，其可能是通过抑制NF-κB的激活，减少ICAM-1和IL-1的表达，从而在肝脏缺血再灌注損伤中起到保护作用。

[关键词] 肝缺血再灌注；白细胞介素-1；细胞间黏附分子-1；核转录因子-κB

[中图分类号] R657.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（c）-0015-04

[Abstract] Objective To observe the protective effect of Major Capillaries Decoction and Bubleurum Decoction on liver ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Liver ischemia-reperfusion model rats were randomly divided into ischemia-reperfusion Chinese medicine group （TCM group， n = 75）， ischemia-reperfusion control group （control group， n = 75）， and sham operation group （sham group， n = 75）. The contents of interleukin-1 （IL-1） in serum， intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） and nuclear factor-kappa B （NF-κB） in rat liver homogenate tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and Western blot. Results After ischemia and reperfusion in three groups， serum IL-1 content gradually increased with the extension of time. In the same time after ischemia-reperfusion， the serum IL-1 content of TCM group was significantly lower than that of the control group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of NF-κB and ICAM-1 in the liver homogenate tissue of TCM group and control group increased gradually with the extension of time， and the expression of TCM group was higher than that of control group at the same time point（P < 0.05）. Conclusion Major Capillaries Decoction and Bubleurum Decoction can significantly alleviate liver ischemia-reperfusion injury in rats. It may be through inhibiting the activation of NF-κB and reducing the expression of ICAM-1 and IL-1 to play a protective role in ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Hepatic ischemia-reperfusion； Interleukin-1； Intercellular adhesion molecule-1； Nuclear factor-κB

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是一种多见于出血性休克、肝脏手术、肝脏移植术等过程中的病理生理过程，是引起肝损伤、肝衰竭及肝脏手术失败的重要原因[1-2]。在HIRI过程中，由于Kupffer细胞和中性粒细胞的活化，产生细胞因子和趋化因子，引起组织炎症的产生，进一步加重肝脏组织的损伤[3]。核转录因子-κB（NF-κB）是一种广泛存在于细胞中具有多向性转录调节作用的蛋白质因子[4]，可诱导多种炎症介质的表达[5]。细胞间黏附因子-1（ICAM-1）是一种特殊的炎症介质，能增强炎症细胞与血管内皮细胞的黏附，加重炎性反应[6]。

通腑泄热法是中医理论的一种重要方法，我们的前期实验提示，通腑泄热法可以通过清除氧自由基，保护肝细胞mtDNA的损伤，修复受损的肝细胞，加强利胆清热祛湿，来保护肝细胞并修复受损肝细胞[7-9]。茵陈蒿汤联合加味大柴胡汤是通腑泄热法的常用方剂，本研究中利用茵陈蒿汤联合加味大柴胡汤对大鼠肝缺血再灌注进行预处理，观察中药对大鼠肝脏缺血再灌注后炎症介质白细胞介素-1（IL-1）和ICAM-1、NF-κB的影响，并分析了其保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD大鼠225只，雌雄不拘，普通饲料喂养至7周龄，200～300 g/只，SD大鼠和饲料均购自广州中医药大学实验动物中心（合格证号：44005900002510）。购入后提供充足食材和水，适应新环境1周后开始实验。

1.1.2 仪器与试药 中药购自广州市红十字会医院，具体中药如下：茵陈20 g、金银花15 g、柴胡15 g、黄芩10 g、栀子10 g、大黄10 g、延胡索10 g、白芍10 g、桂枝10 g、黄芪15 g、蒲公英10 g、猪苓10 g、泽泻15 g、芒硝5 g，日1剂，水煎100 mL。离心机为德国艾本德离心机5810R；IL-1α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自武汉华美公司（CSB-E04622r）；ICAM-1抗体购自Bioss公司（bs-0608R）；NF-κB抗体购自SANTA CRUZ公司（Sc-372）；GAPDH（内参）抗体购自abcam公司（Ab181602）；Western blot分析系统为杭州朗基科学仪器有限公司的LG2000数码凝胶图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HIRI模型的建立 参照文献[10]建立大鼠HIRI模型：术前大鼠禁食12 h，自由进水，经腹腔注射戊巴比妥（0.5 mL/100 g）麻醉，麻醉成功后，仰卧固定于操作台上，取上腹部正中切口，充分显露第一肝门部，用无创性微血管夹夹闭第一肝门，以阻断肝脏的血供，阻断后可见整个肝脏颜色逐渐变暗，呈灰暗色缺血改变，胃肠处于瘀血状态呈暗红色。30 min后松开血管夹，进入再灌注阶段，可见肝脏、胃肠逐渐恢复鲜红色，暗红色变为鲜红色说明肝脏再灌注成功，若复流不畅则终止实验。

1.2.2 实验分组 将SD大鼠雌雄不拘，按照随机数字表法随机分为缺血再灌注中药组（TCM组，n = 75）、缺血再灌注实验组（Control组，n = 75）和假手术组（Sham组，n = 75）。TCM组：术前按照5 mL/次中药剂量，每日2次，予以连续灌胃3 d，术中打开腹腔后，显露第一肝门部并阻断，30 min后松开血管夹，进入再灌注阶段；Control组：术前按照5 mL/次生理盐水剂量，每日2次，予以连续灌胃3 d，术中打开腹腔后，显露第一肝门部并阻断，30 min后松开血管夹，进入再灌注阶段；Sham组：术前正常饲养3 d，术中打开腹腔显露第一肝门部后，不予阻断肝门。

1.2.3 血液及肝脏组织标本的收集 分别于肝缺血再灌注后1、3、6 h采血和肝组织：每只大鼠每次下腔静脉采血1 mL，然后用超速离心机（半径9.5 cm，转速3500 r/min）分离出血清待检；切取适量肝脏组织（约1 cm×1 cm×1 cm）后放入-80℃低温冰箱中保存备用。

1.2.4 血清中IL-1含量检测 运用ELISA法检测大鼠血清中IL-1的含量，操作按试剂盒说明书进行。

1.2.5 肝脏匀浆组织中NF-κB和ICAM-1的蛋白含量检测 运用Western blot法检测肝脏匀浆组织NF-κB和ICAM-1的蛋白含量，操作按说明书进行。运用数码凝胶图像分析系统检测阳性表达，图谱条带越暗，阳性产物表达越多，计算并比较各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差齐性检验和方差分析，两两比较采用Sidak的t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠血清IL-1含量变化比较

在相同缺血再灌注时间点，TCM组血清IL-1含量均比Control组大鼠低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；随着肝缺血再灌注时间的延长，三组大鼠血清IL-1的含量均逐渐升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 三组大鼠术后NF-κB和ICAM-1的表达水平比较

随着肝缺血再灌注时间的延长，TCM组和Control组大鼠肝组织匀浆中NF-κB和ICAM-1的Western blot图谱条带越来越暗，且Control组各个时间点NF-κB和ICAM-1的暗度均大于TCM组；Sham组大鼠肝组织匀浆中NF-κB和ICAM-1的Western blot图谱条带变化不明显。见图1。TCM组各时间点NF-κB和ICAM-1的表达水平均明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

HIRI机制目前仍不十分清楚，但其通过推动自身放大的炎性反应对肝实质造成损伤已得到公认[11]。在HIRI過程中，由于急性炎症的产生，引起肝细胞损伤，进一步发展可导致肝细胞的凋亡[12]。NF-κB是一种转录因子，可调控炎性反应，在细胞受到某些炎性细胞因子、氧化应激等刺激时，可激活NF-κB，调节炎性细胞因子、细胞间黏附分子的表达及炎性反应[13]。黏附分子是细胞膜表面糖蛋白，广泛分布于血管内皮细胞和各种白细胞表面，它通过与其受体的特异性结合，使白细胞、炎症细胞与内皮细胞间的黏附作用增强，从而参与炎性反应、细胞的信号转导与活化、免疫应答等生理病理过程[14]。NF-κB信号通路在黏附分子的表达中起重要作用，通过抑制NF-κB信号传导可减少ICAM-1的表达[15]。有研究表明，在大鼠的HIRI中，缺血再灌注可显著增加肝细胞中NF-κB的表达以及促炎细胞因子IL-1的水平，从而引起肝脏损伤[16]。本研究对大鼠的HIRI不同研究组IL-1、NF-κB和ICAM-1的含量变化进行分析，结果提示当发生HIRI时，随着时间延长，IL-1和ICAM-1的表达增加与NF-κB的调控增强有关。

中醫中药可以通过不同的途径和机制减轻HIRI：茵陈蒿汤不仅可以促进胆红素代谢，还可抑制肝细胞凋亡[17]；加味大柴胡汤能抑制氧自由基产生，起到保护肝功能作用[18]；另外，加味大柴胡汤具有明显的抗炎、降酶、降低肿瘤坏死因子作用，也能够通过减少自由基的产生，减轻脂质过氧化损伤和线粒体内钙超载，从而起到减轻肝脏损伤的作用[19]。本研究通过通腑泄热法常用的茵陈蒿汤联合加味大柴胡汤加减，对HIRI大鼠肝组织中的NF-κB、ICAM-1和血清中IL-1含量进行研究，结果表明，中药预处理可下调HIRI大鼠的NF-κB水平，并降低IL-1和ICAM-1的表达水平。在HIRI中，NF-κB和炎性反应密切相关，NF-κB的激活可促进促炎性细胞因子的释放，引起肝脏损伤[20]；而抑制NF-κB途径可以降低炎性细胞因子IL-1的表达[21]。因此，通腑泄热法对大鼠HIRI的保护作用机制与抑制NF-κB的激活，减少ICAM-1和IL-1的表达有关，从而减轻HIRI，起到对肝脏的保护作用。

[参考文献]

[1] Meng GX，Yuan Q，Wei LP，et al. Protein kinase C-β inhibitor treatment attenuates hepatic ischemia and reperfusion injury in diabetic rats [J]. Exp Ther Med，2016，11（2）：565-570.

[2] Teoh NC，Ajamieh H，Wong HJ，et al. Microparticles Mediate Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury and Are the Targets of Diannexin （ASP8597）[J]. PLoS One，2014，9（9）：e104376.

[3] Zhai Y，Petrowsky H，Hong JC，et al. Ischaemia-reperfusion injury in liver transplantation-from bench to bedside [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2013，10（2）：79-89.

[4] Su P，Liu X，Pang Y，et al. The archaic roles of the lamprey NF-κB（lj-NF-κB）in innate immune responses [J]. Mol Immunol，2017，92：21-27.

[5] Duval F，Moreno-Cuevas JE，González-Garza MT，et al. Liver fibrosis and mechanisms of the protective action of medicinal plants targeting inflammation and the immune response [J]. Int J Inflam，2015，2015：943497.

[6] Dabrowski A，Osada J，Dabrowska MI，et al. Increased expression of the intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）on peripheral blood neutrophils in acute pancreatitis [J]. Adv Med Sci，2014，59（1）：102-107.

[7] 苑伟.通腑泄热法对梗阻性黄疸肝细胞mtDNA氧化损伤的保护作用研究[D].广州：广州中医药大学，2014.

[8] 王百林，苑伟，翟淑萍，等.梗阻性黄疸兔肝细胞线粒体氧化损伤的作用及机制[J].中华实验外科杂志，2014，31（11）：2393-2395.

[9] 王百林，苑伟，翟淑萍，等.利胆消黄汤对梗阻性黄疸兔肝细胞线粒体DNA损伤修复的研究[J].中华实验外科杂志，2015，32（11）：2636-2638.

[10] 余淑珍，郭永清，郑李娜，等.SD大鼠急性全肝缺血再灌注模型建立与改良[J].中国药物与临床，2016，16（1）：28-30.

[11] Zhai Y，Busuttil RW，Kupiec-Weglinski JW. Liver ischemia and reperfusion injury：new insights into mechanisms of innate-adaptive immune-mediated tissue inflammation [J]. Am J Transplant，2011，11（8）：1563-1569.

[12] Su S，Luo，Liu X，et al. miR-494 up-regulates the PI3K/Akt pathway via targetting PTEN and attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in a rat model [J]. Biosci Rep，2017，37（5）：BSR20170798.

[13] Lin TH，Pajarinen J，Lu L，et al. NF-κB as a Therapeutic Target in Inflammatory-Associated Bone Diseases [J]. Adv Protein Chem Struct Biol，2017，107：117-154.

[14] Anbarasan C，Bavanilatha M，Latchumanadhas K，et al. ICAM-1 molecular mechanism and genome wide SNP's association studies [J]. Indian Heart J，2015，67（3）：282-287.

[15] Jing SH，Xuan G，Bo Y，et al. Raf Kinase Inhibitor Protein（RKIP）Inhibits Tumor Necrosis Factor-α（TNF-α）Induced Adhesion Molecules Expression in Vascular Smooth Muscle Bells by Suppressing（Nuclear Transcription Factor-κB（NF-kappaB）Pathway [J]. Med Sci Monit，2017，23：4789-4797.

[16] He D，Guo Z，Pu JL，et al. Resveratrol preconditioning protects hepatocytes against hepatic ischemia reperfusion injury via Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway in vitro，and in vivo [J]. Int Immunopharmacol，2016，35：201-209.

[17] 華圆，冯健，李范珠.茵陈蒿汤利胆退黄物质基础的研究进展[J].中华中医药学刊，2011，29（7）：1520-1521.

[18] 费国新.加味大柴胡汤辅助治疗原发性肝癌合并阻塞性黄疸的临床观察[J].湖北中医杂志，2010，32（9）：36-37.

[19] 林木生，王三明，包仕廷，等.加味大柴胡汤加用L-精氨酸对阻黄大鼠血浆内毒素的影响[J].中华实验外科杂志，2004，21（10）：1202-1203.

[20] Robertson FP，Fuller BJ，Davidson BR. An Evaluation of Ischaemic Preconditioning as a Method of Reducing Ischaemia Reperfusion Injury in Liver Surgery and Transplantation [J]. J Clin Med，2017，6（7）：E69.

[21] Yu Q，Zeng KW，Ma XL，et al. Ginsenoside Rk1 suppresses pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells by inhibiting the Jak2/Stat3 pathway [J]. Chin J Nat Med，2017，15（10）：751-757.