灵芝多糖拌种对小麦抗纹枯病的诱导效应及生长发育影响

张中霄 ，王红艳 ，王开运，王东，姜莉莉

（1山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018；2山东农业大学农学院，山东泰安 271018）

0 引言

【研究意义】小麦纹枯病又称小麦尖眼点病（sharp eyespot of wheat），是由立枯丝核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染引起的一种世界性的土传性真菌病害[1-2]，一般使小麦减产10%—20%，严重地块减产 50%左右，个别地块甚至绝收[3]，已成为中国小麦稳产、高产的主要障碍之一。目前国内对该病的防治主要是采用喷洒井冈霉素或者使用三唑类杀菌剂拌种。由于单一或同类杀菌剂的长期频繁使用，小麦纹枯病菌已对多种杀菌剂产生了敏感性降低的情况，防治效果受到影响[4]。植物免疫诱抗剂能够激活植物体内分子免疫系统，提高植物抗病性[5]，对降低农田化学农药使用量、保障农产品质量安全具有积极作用[6-7]。【前人研究进展】研究表明，植株经诱导物诱导后，体内产生PR蛋白，其过氧化物酶（POD）、几丁质酶、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均大幅度增加[8]。向妙莲等[9]研究表明，茉莉酸甲酯能提高水稻叶片中 POD、过氧化氢酶

究物的生产导表相除等系长多的导苗纹（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、PPO和 PAL活性，诱导水稻幼苗对白叶枯病的抗性。张文清等研

表明，壳寡糖、香菇多糖等多种功能糖能够调节作生长，诱导激活植株的防御反应，增强植物对病害抵抗能力，从而诱导植株对植物病毒和真菌病害产抗性[10-11]。海带多糖可刺激葡萄、水稻和烟草细胞生防御反应，将其施用于葡萄和烟草植株上可诱植株体内植保素的累积和一系列病程相关蛋白的达[12-14]。灵芝多糖与许多已经报道的真菌多糖结构一致，同属于β-(1→3)-葡聚糖类[15-17]，能够有效消生物体内的各种自由基，延缓植株衰老[18]。宁玉波[19]报道灵芝多糖能够诱导番茄植株对灰霉病产生统抗病性，同时对番茄种子发芽和番茄植株幼苗生具有一定的促进作用。【本研究切入点】关于灵芝糖拌种防治小麦纹枯病目前尚未见报道。【拟解决关键问题】以小麦为研究对象，以灵芝多糖作为诱子，通过拌种的方式研究灵芝多糖对小麦发芽、幼生长和根系活力的影响。观察灵芝多糖诱导小麦抗枯病的效果，并通过测量小麦体内保护酶的活性、丙二醛（MDA）以及叶绿素a、叶绿素b的含量来探究其诱抗机制，为灵芝多糖拌种在小麦病害防治上的推广应用提供依据。

1 材料与方法

试验于 2015—2016年在山东农业大学植物保护学院完成。

1.1 供试材料

小麦品种：选用对小麦纹枯病的高感品种济麦22、中感品种山农23、中抗品种鲁原502，由山东农业大学农学院提供；供试药剂：25%灵芝多糖原粉由济宁圣鹏化工有限公司提供；供试菌株：小麦纹枯病菌由山东农业大学农业微生物省重点实验室保存菌种，经活化、纯化后供试。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦发芽和出苗试验 将灵芝多糖按照4、8 g a.i./100 kg小麦种子的剂量进行拌种处理。发芽试验：参照李山东等[20]方法略有改动，记录并计算各处理的发芽势和发芽率。计算公式：发芽势（%）=（第3天各处理发芽种子粒数/供试种子粒数）×100；发育率（%）=（第6天各处理发芽种子粒数/供试种子粒数）×100。出苗试验：参照党志红等[21]方法略有改动，小麦拌种后置于山东农业大学温室中培养，于出苗后7、14、21 d记录作物的生长状况，统计各处理间的株高。

1.2.2 灵芝多糖拌种对小麦根系活力影响的测定

根系活力的测定采用TTC法[22]。

1.2.3 灵芝多糖拌种对小麦叶绿素含量影响的测定 参考彭运生等[23]的方法，测定不同浓度的灵芝多糖处理21 d后对小麦叶绿素a和叶绿素b含量的影响。

1.2.4 灵芝多糖盆栽防效 将灵芝多糖按照 4、8 g a.i./100 kg小麦种子的剂量拌种，以清水处理为对照（CK）。将营养一致、颗粒均匀、含水量约60%的土壤装于塑料花盆中。每盆混入20 mL相同浓度的纹枯病菌培养液后，播种10粒处理过的种子为1个重复，每个处理重复3次。置于温室中培养，于出苗后7、14、21 d记录发病率和病情指数。按照公式（1）和（2）分别计算。

1.2.5 抗病相关酶的活性测定 粗酶液的制备参照刘太国等[24]方法略有改动。于灵芝多糖处理小麦种子出苗21 d后，取小麦最上端的叶片用于测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性。POD活性的测定参考愈创木酚法[25]；SOD活性测定采用NBT光化还原法[26]：PAL活性测定采用李合生[27]的方法。

1.2.6 灵芝多糖拌种对小麦 MDA含量影响的测定参照李合生[27]的方法，采用硫代巴比妥酸法测定MDA 的含量（μmol·g-1）。

2 结果

2.1 灵芝多糖拌种对小麦生长发育的影响

2.1.1 对小麦种子发芽的影响 灵芝多糖拌种后小麦发芽势均高于对照，其中高感品种济麦22和中感品种山农23与对照组差异显著。剂量为4 g a.i./100 kg小麦种子的灵芝多糖拌种后济麦22、山农23和鲁原502的发芽势为53.50%、52.75%、51.50%，高于对照的50.25%、50.50%、50.50%。对照完全发芽后，灵芝多糖拌种处理组与对照组的发芽率均接近 100%，无显著性差异（表1）。

表1 灵芝多糖拌种对小麦种子发芽的影响Table 1 Effects of G. lucidum polysaccharides (GLP) seed dressing on germination of wheat

2.1.2 对小麦幼苗生长的影响 灵芝多糖种子处理对小麦生长具有促进作用，灵芝多糖处理3个品种小麦种子完全出苗后7、14 和21 d的株高均显著高于对照。在小麦完全出苗7 d，灵芝多糖8 g a.i./100 kg种子处理组的济麦22、山农23和鲁原502株高分别为8.81、8.75和11.96 cm，显著高于灵芝多糖4 g a.i./100 kg种子处理组的 8.03、7.50和 9.84 cm和对照组的7.35、6.28和7.01 cm，可见随着灵芝多糖浓度的升高对小麦初期发育的促进作用更加明显。在小麦完全出苗21 d后灵芝多糖两个处理组的株高没有显著差异，但都显著高于空白对照组（表2）。

表2 灵芝多糖拌种对小麦幼苗生长的影响Table 2 Effect of GLP seed dressing on the growth of wheat seedlings

2.1.3 对小麦根系活力的影响 灵芝多糖拌种能显著提高小麦根系的活力。灵芝多糖8 g a.i./100 kg种子处理后21 d济麦22、鲁原502和山农23的根系活力分别为 0.26、0.33 和 0.26 mg·g-1·h-1，显著高于4 g a.i./100 kg种子处理的根系活力（0.19、0.28、0.20 mg·g-1·h-1）以及空白对照的根系活力（0.10、0.21 和0.11 mg·g-1·h-1）（图 1）。

2.1.4 对小麦叶片叶绿素 a和叶绿素 b含量的影响灵芝多糖拌种后小麦叶片叶绿素a和叶绿素b的含量均有所上升。灵芝多糖4 g a.i./100 kg种子处理后，济麦22、鲁原502和山农23叶绿素a的含量为1.54、1.53、1.86 mg·g-1，显著高于空白对照 1.29、1.33和1.51 mg·g-1；叶绿素 b的含量为 0.80、0.79和 0.90 mg·g-1，显著高于空白对照 0.67、0.67 和 0.76 mg·g-1。并且随着灵芝多糖使用量的提高，叶绿素a和叶绿素b的含量也是有明显上升（图2）。

图1 灵芝多糖拌种对小麦根系活力的影响Fig. 1 Effect of GLP on root activity of wheat

图2 灵芝多糖拌种对小麦叶片叶绿素含量的影响Fig. 2 Effect of GLP seed dressing on the chlorophyll content of wheat leaves

2.2 灵芝多糖拌种对小麦纹枯病的诱导作用

剂量为4和8 g a.i./100 kg种子的灵芝多糖拌种处理后，对小麦纹枯病均具有一定的防治效果。其中，8 g a.i./100 kg种子剂量的灵芝多糖拌种处理，在小麦出苗 7 d后对小麦纹枯病的防治效果均在30%以上，并且持效期较长，对济麦 22、山农 23和鲁原502的21 d的防治效果分别为30.4%、26.6%和29.4%（表3）。

2.3 灵芝多糖拌种对小麦防御酶活性和 MDA含量的影响

灵芝多糖拌种后小麦叶片防御酶的活性显著上升。4 g a.i./100 kg种子处理21 d后，济麦22、鲁原502和山农23 PAL活性分别为60.32、57.52和53.12 U·min-1·g-1FW，显著高于空白对照的55.06、53.60和50.53 U·min-1·g-1FW。而 8 g a.i./100 kg 种子剂量灵芝多糖处理与4 g a.i./100 kg处理组并没有显著差异（图3-A）。SOD、POD活性显著上升，并且随灵芝多糖处理浓度的升高而升高，当处理浓度为8 g a.i./100 kg时防御酶活性达到顶峰。8 g a.i./100 kg种子剂量灵芝多糖拌种后济麦22、鲁原502和山农23的POD活性分别为 135.67、137.53 和 129.73 U·min-1·g-1FW，是空白对照的1.13、1.18和1.17倍（图3-B）；SOD活性分别为2.45、2.34和2.55 U·g-1FW，是空白对照的1.32、1.26和1.21倍（图3-C）。

灵芝多糖拌种后，3个小麦品种叶片 MDA的含量均显著降低。8 g a.i/100 kg灵芝多糖处理济麦22、鲁原502和山农23种子21 d后，MDA的含量为分别1.48、1.38 和 1.58 μmol·g-1，比空白对照降低 26.1%、27.1%和19.7%（图3-D）。

图3 灵芝多糖拌种对小麦叶片保护酶活性及丙二醛含量的影响Fig. 3 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after GLP seed dressing in wheat

3 讨论

植物免疫诱抗剂能够提高农作物抗性和有效防控农作物病害。2002 年，ASAI等[28]报道植物本身存在有效的保护机制，可帮助植物抵抗霉菌和细菌的侵染。真菌多糖具有促进种子萌发和幼苗生长的作用，单宏英等[29]研究发现，香菇多糖可以促进烟草种子的萌发。本研究发现，灵芝多糖拌种后可增强小麦发芽势和幼苗生长。植株叶绿素含量的高低直接反映光合作用的强弱，叶绿素含量越高叶片光合作用越强，产生的能量和积累的有机物质也就越多，抗性也随之增强。颜惠霞等[30]研究表明，南瓜叶片中叶绿素含量与南瓜品种对白粉病的抗性呈正相关。本试验发现灵芝多糖拌种后小麦叶片的叶绿素a和叶绿素b均显著提高，表明灵芝多糖拌种可以在一定程度上提高小麦的光合作用，增强植物的抗病性。

表3 灵芝多糖拌种对小麦纹枯病的诱导作用Table 3 Induction effect of GLP seed dressing against sharp eyespot of wheat

国内外已有许多文献报道了真菌多糖能调节作物生长、激活植物机体免疫、诱导植株自身产生抗病性，使植株获得系统抗病性（systemic acquired resistance，SAR）[31-35]。本研究结果证明，用不同浓度的灵芝多糖对3个小麦品种拌种处理，均可诱导小麦对纹枯病产生抗性。灵芝多糖8 g a.i./100 kg拌种后对小麦纹枯病的防治效果在30%以上，并且持效期可达到21 d。小麦不同品种对小麦纹枯病的抗性存在差异，为降低试验的偶然性，笔者选用对小麦纹枯病高感品种济麦22、中感品种山农23、中抗品种鲁原502进行灵芝多糖的诱导抗性试验，然而3个不同品种经灵芝多糖拌种后对小麦纹枯病的防治效果上并没有显著差异，这可能是因为温室盆栽试验人为促使小麦发生纹枯病害，导致不同品种之间的差异性并不显著。

王关林等[36]研究表明，植物抗逆境的能力与保护酶活性有着十分密切的关系。PAL是植物苯丙烷类代谢途径的限速酶和关键酶，参与植物类黄酮、木质素和香豆酸酯类等次生代谢的形成，对植物的抗虫、抗病、抗逆及生长发育具有重要作用[37-41]。POD活性与植物的抗病性具有正相关性，能够延缓植物衰老[42-43]，并且SOD和POD可以协同作用清除活性氧自由基，以减轻活性氧自由基对植株的危害。本试验表明，灵芝多糖拌种后的小麦植株体内PAL、POD和SOD活性均较对照组有所提高，这可能是在一定程度上提高小麦对纹枯病菌侵染能力的防御机制之一。MDA是膜脂过氧化作用的产物之一，其含量可反映植物对逆境条件反应的强弱和细胞膜损伤程度[44]。本试验发现经灵芝多糖拌种后小麦植株MDA含量明显低于空白对照处理组的含量，表明经灵芝多糖拌种后对 MDA含量有一定的抑制作用，从而可减少膜质过氧化作用对细胞的伤害，提高植株对病害的抗逆能力。由于小麦纹枯病为土传病害并且病菌致病力强，诱导剂的效果不易发挥，灵芝多糖作为抗病诱导剂单独使用防治小麦纹枯病效果不十分显著。在使用化学杀菌剂防治植物病害的同时，通过配施生物诱抗剂提高植物抗病性、促进作物生长，是降低化学药剂使用量并保证作物产量的有效途径。李鹏鹏[45]报道，香菇多糖和新型杀菌剂氟嘧菌酰胺和适量混用，或两者交替使用，能够分别减少氟嘧菌酰胺用量的25%和50%，并且明显提高对黄瓜霜霉病的防治效果；WILINGHAM 等[46]报道，嘧菌酯与氟唑活化酯（BTH）联合施用对百香果疮痂病的防治持效期可达25 d以上。近年来，如何减少农药使用量降低农产品中农药残留成为普遍关注的问题，生物诱抗剂与化学药剂联合使用不仅能够增强对植物病害的防治效果，还能减少化学农药的使用量并延长药剂的持效时间，将成为未来防治植物病害的研究热点。

4 结论

灵芝多糖拌种能够诱导小麦植株抗纹枯病，小麦经8 g a.i./100 kg种子剂量的灵芝多糖拌种后对小麦纹枯病的防治效果在30%左右。经灵芝多糖拌种后小麦叶片防御酶的活性提高，叶绿素的含量增加，丙二醛的含量降低。同时灵芝多糖拌种对小麦种子发芽和幼苗生长具有一定的促进作用。

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