甘蔗对干旱胁迫的响应及抗旱基因遗传转化研究进展

徐 荣 ，李富生 ，2，何丽莲 ，2*

（1.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；2.云南农业大学甘蔗研究所，昆明 650201）

甘蔗（Saccharum officinarum L.）属于禾本科、甘蔗属植物，是世界和我国最主要的糖料作物，也是极具开发潜力的能源作物。现代甘蔗栽培品种是由“甘蔗属”内的主要“种”（包括栽培种和野生种）通过“种间杂交”和“高贵化育种”选育而来[1]。甘蔗属及其近缘野生种等种质资源是甘蔗育种的基因库。一般认为，甘蔗的高产、髙糖等性状主要来自热带种（S.officinarum L.），而抗旱、耐寒、抗病虫、分蘖等特性则主要来自野生种（如：割手密S.spontaneum L.，也称细茎野生种）[2]。随着甘蔗抗性育种不断发展，育成的品种使得甘蔗种植区域逐渐从热带向亚热带和温带、从水田向丘陵旱地扩展[3]。甘蔗生长周期长，植株高大，对水分的需求量多，但由于我国甘蔗生产生态条件差（蔗区85%以上为旱坡地）[4]、干旱灾害频繁，所以急需抗旱性强的甘蔗品种。尽管常规甘蔗育种（有性杂交育种）仍是目前选育抗旱品种的主要途径，但由于甘蔗遗传背景复杂，对于目标性状的获得往往带有很大的随机性和偶然性，导致育种效率不高。近年来，随着生物技术的快速发展，利用基因工程技术对甘蔗品种进行有针对性的遗传改良已逐渐成为常规甘蔗育种途径的有效补充。

1 甘蔗对干旱胁迫的响应机制

甘蔗生长发育对水分的要求比较高，水分直接参与甘蔗的代谢、物质吸收和转化过程，严重缺水会影响甘蔗的萌芽、分蘖、伸长、叶片扩展、成熟等的生长发育过程，从而最终影响到甘蔗的产量及品质。目前，我国有85%以上的蔗区分布在无灌溉条件的旱坡地，使得我国甘蔗产业的发展很大程度受限于立地条件差以及干旱的频繁发生。因此，对甘蔗栽培品种的抗旱适应能力也就提出了越来越高的要求[4]，甚至在很大程度上，甘蔗品种的抗旱能力也就决定着甘蔗产业的效益和发展前景[2]。

许多甘蔗品种对干旱缺水可以有多种适应方式，包括御旱性、耐旱性、避旱性等几种方式，这些方式之间没有严格的界限，御旱性和耐旱性被统称为抗旱性。御旱性属于形态学抗旱范畴，是指在水分胁迫下，甘蔗为了保持正常的生理生化状态，通过限制水分的丧失维持体内较高的水势，使细胞处于正常的微环境中；耐旱性属于生理生化抗旱范畴，是指甘蔗通过有机溶质的累积有助于产生低的渗透势，仍能保持细胞原生质及其主要器官在严重脱水情况下减轻伤害，并迅速产生由胁迫应答基因调控及表达相关的生理生化反应[5]。

在水分胁迫下，甘蔗会调整下游相关基因的表达，也可以直接作为功能蛋白使植物细胞免受水分胁迫的影响，最终使植株表现出对水分胁迫的适应性或抗耐性。目前，对植物干旱胁迫的分子机制尚不完全清楚。相关研究表明植物通过大量的Ca2+依赖激酶[6]、有丝分裂原相关激酶[7]等对下游蛋白进行可逆磷酸化，从而激活或抑制一系列的转录因子调控基因的表达，在这一过程中，植物激素乙烯、脱落酸（ABA）、乙酰水杨酸等含量会发生变化[8-9]，同时将干旱胁迫信号放大传递，从而改变植物的生理生化特征，提高抗旱能力，在植物的激素调节中，脱落酸处于中心地位。研究表明ABA不仅调控植物整个发育过程，同时也能在不同环境信号中起桥梁作用。ABA是植物细胞适应干旱的关键因子，在植物抗逆反应中起着重要作用，能够启动植物抗旱的响应机制[10-11]。同时还发现，在干旱响应过程中，ABA不仅能够改变植物细胞的转录水平，而且能够影响植物其他重要的基础代谢过程，包括植物脂类代谢和碳代谢，这也从另一个方面暗示了ABA在这个植物响应干旱的中心地位[12]。

2 与抗旱相关的几类基因家族

随着分子生物学的发展及生物技术的广泛应用，越来越多的研究者克隆了与作物抗旱相关的基因，并就干旱胁迫诱导基因产物的功能及表达调控进行了深入研究。在甘蔗方面，近缘野生种斑茅的抗旱相关基因（deta-OAT、FKBP12，等）[13-14]和野生种割手密 3 个抗旱相关基因（ScNAC1、ScDREB、ScALDH）[15-17]已被克隆。

2.1 NAC类转录因子

NAC类转录因子是一类具有多种生物功能的植物特有的转录因子，该基因家族在植物发育和逆境响应中起重要作用[18]。NAC转录因子包含一个N端高度保守的结构域和C端分化的调控域，N端包含5个亚结构域(A~E)，由大约160个氨基酸残基组成，B和E亚结构域的保守性不强，A、C、D亚结构域则高度保守，在C、D序列中包含核定位信号，因此NAC转录因子可与特定的启动子元件相互识别，而NAC蛋白的C-末端区域则是高度发散的，从而使转录激活调控出现多样性[19]。

NACs在植物的生长发育过程中扮演着重要的角色，包括花的发育和形态的形成、芽顶端分生组织的形成和维持、胚胎的发育、激素的信号和次生壁的形成等。Guo和Gan[20]通过研究发现，在拟南芥中克隆的AtNAP的NAC转录因子与叶片的衰老有关，其过量表达会造成植株的早熟性衰老。

植物的NACs基因与应对生物和非生物胁迫是密切相关的，已应用于植物转基因工程研究[21]。Sun等[22]在水稻中发现两个响应病原的NAC转录因子，分别为OsNAC122和OsNAC131，细胞定位发现其在细胞核并具有转录活性。在侵染稻瘟病菌后，OsNAC122和OsNAC131的表达被诱导，基因沉默则能够提高稻瘟病菌的易感性。在转基因水稻中，OsNAC6的过量表达呈现出对脱水、高盐胁迫和稻瘟病的耐受性[23]。Luo等[24]发现SbSNAC1在高粱的干旱和盐胁迫等非生物胁迫响应中扮演着重要的角色，在高浓度条件下也在根中表达，其能够响应植物激素脱落酸。Nogueira等[25]从甘蔗中鉴定出了26个NAC类转录因子的家族成员，研究发现其中ScNAC23与低温胁迫诱导有关，该基因的表达受水分胁迫和虫害胁迫诱导。

2.2 DREB类转录因子

DREB(dehydration responsive element binding protein)类转录因子即缺水响应元件结合蛋白，能特异地结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件，在低温、干旱和盐碱等逆境胁迫下，通过调节下游逆境应答基因的表达来提高植物的抗逆性。DREB转录因子蛋白具有典型的结构特征，富含碱性氨基酸的N-末端是核定位信号区，富含酸性氨基酸的C-末端是转录激活区，中间由58个氨基酸残基组成的AP2/EREBP结构域，特别是位于第2个β-折叠中的第14位的缬氨酸，在DREB转录因子与DRE顺式元件的特异性结合起关键作用[26]。

干旱、低温等逆境胁迫是如何激活DREB转录因子表达，Gilmour等[27]提出了ICE（Inducer of CBF Expression）理论，即在细胞中存在一个上游转录因子，它在常温下以非活性形式存在，在低温胁迫下可以被激活，并能与DREB的启动子结合而开始转录。在DREB转基因植物中，过表达可以激活靶基因的表达，提高植物对低温、干旱等逆境的忍耐力。Dubouzet等[28]克隆了水稻DREB类转录因子OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C等基因，并发现水稻原生质中的OsDREB1A、OsDREB1B能与DRE特异结合，在拟南芥中过表达OsDREB1A，可以提高其对干旱、高盐和冷害的耐受力。Liu等[29]研究转入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的转基因拟南芥，发现转基因植株耐干旱胁迫的能力显著高于野生型。Tian等[30]克隆了水稻DREB类转录因子：OsDREB1-1、OsDREB4-1、OsDREB4-2基因，在水稻幼苗中，OsDREB1-1和OsDREB4-2呈组成性表达，而OsDREB4-1受干旱和高盐胁迫诱导表达，研究表明其可能在胁迫响应通路中DRE/DREB作为反式作用因子行使功能。DREB转录因子具有复杂的作用机理，如DREB1A和DREB1D序列具有很高的同源性，DREB1D不能被低温诱导但DREB1A可被低温逆境诱导。功能相同的OsDREB1A和DREB1A，DREB1A能结合DRE的核心序列即ACCGAC和GCCGAC序列，而OsDREB1A只能特异结合GCCGAC序列[31]。总之，DREB转录因子对调控逆境诱导基因的表达起着关键作用，其能增强植物对多种逆境的适应性和抵抗力，在提高植物综合抗逆性方面有着广阔的应用前景。同时，鉴于DREB转录因子在信号转导、作用机理及基因表达等方面的复杂性，还需要对其进行更深层次的探讨。

2.3 ALDH类醛脱氢酶

醛脱氢酶基因（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）是一类编码将醛脱氢氧化为相应羧酸的功能基因[32]。在环境胁迫下，生物体内会产生醛类物质，过量积累的醛类会与蛋白质和核酸反应并形成加合物，进一步破坏蛋白质和核酸的正常结构及功能。ALDH在生物体中具有四种主要功能：脱毒、参与代谢、渗透保护和NAD(P)H的再生[33]，ALDH基因家族具有一定保守性，但目前还未有关于植物ALDH保守区功能的研究和报道。

目前在植物中发现的ALDH包括14个家族，不同家族成员分别参与乙醛的氧化脱毒，参与盐、干旱、重金属、脱落酸等逆境胁迫的响应[34]，其中最初从菠菜中分离得到的甜菜碱醛脱氢酶基因属于ALDH10家族，是目前研究最多的一类ALDH基因，其催化甜菜碱醛脱氢氧化为甘氨酸甜菜碱，在干旱和盐胁迫条件下，能诱导甜菜碱醛脱氢酶的上调表达，合成大量的甘氨酸甜菜碱，从而提高了细胞在逆境下渗透调节的能力[35]。ALDH还参与结氨酸降解为丙酰CoA的代谢途径以及脯氨酸的代谢途径等[36]。Gao等[37]检测了干旱和盐胁迫对水稻幼叶中不同ALDH基因家族表达的影响，发现水稻OsALDH2-4、OsALDH3-4、OsALDH7、OsALDH10-1和OsALDH18-2能同时被干旱和盐胁迫上调表达，OsALDH2-2、OsALDH3-1和 OsALDH3-2同时被干旱和盐胁迫下调表达。张积森等[38]在甘蔗中克隆了琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）基因，该基因参与甘蔗干旱胁迫下的信号转导，并与钙离子之间存在调控关系。最初发现于念珠藻中，后来在微生物中也发现了的ALDH21基因家族，干旱、ABA和NaCl处理均能诱导其蛋白的上调表达，表明ALDH21基因可能在植物应对逆境胁迫时发挥重要作用[39]。ALDH对环境胁迫的响应具有交叉性，研究ALDH应对胁迫的响应机理，将有助于我们深入了解ALDH缓解各种逆境胁迫的机制。

3 甘蔗抗旱转基因研究进展

甘蔗遗传背景复杂、高度杂合且无性繁殖，利用常规杂交育种方法难以准确实现定向遗传改良，转基因技术能够有针对性地将外源基因导入到甘蔗中，加快甘蔗的育种进程。植物转基因广泛应用基因枪法和农杆菌介导法，在甘蔗转基因研究初期，主要使用基因枪法，具有不受宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高、操作简便和快速等优点。Bowers和Birch于1992年用基因枪法获得了转基因甘蔗[40]。随着成功率高、遗传稳定性好的农杆菌介导方法不断发展和优化，其在甘蔗转基因研究中逐渐得到广泛应用[41]。

由于甘蔗的抗旱性是由多基因控制的数量性状，目前对甘蔗抗旱机制的了解还非常有限，甘蔗抗旱转基因研究基本是从抗旱功能基因和转录因子以及蛋白激酶类信号因子等方面开展的。抗旱功能基因编码的蛋白质在干旱胁迫下对细胞直接起保护作用，主要包括渗透调节剂脯氨酸、甜菜碱、果聚糖、甘露醇等，过氧化保护剂超氧化物歧化酶、过氧化酶、过氧化氢酶等，以及分子伴侣晚期胚胎发生丰富蛋白、水通道蛋白等。Zhang等[42]研究显示海藻糖合成酶转基因甘蔗中海藻糖含量达8.805～12.863mg/g，而非转基因植株体内未检测到海藻糖的含量，通过测定一系列生理指标，表明转海藻糖合成酶基因甘蔗的抗旱性显著增强。Molinari[43]等对脯氨酸合成酶转基因甘蔗进行了功能验证，结果显示转基因甘蔗在水分亏缺时可诱导脯氨酸大量积累，起到渗透调节剂的作用从而提高了抗旱性。在非生物胁迫过程中产生的一类对下游基因具有重要调控作用的蛋白即是转录因子，依据转录因子蛋白结构域的不同可分为MYB、bZIP、NAC和DREB等不同转录因子家族，过量表达SNAC1的转基因水稻，营养和生殖生长期的耐旱性都显著提高[44]。Sruthy[45]等将从斑茅中克隆得到的EaHSP70基因导入甘蔗，转基因植株表现出更高的细胞膜热稳定性、叶绿素含量和光合效率。Anisur[46]分析了TERF1和TSRF1转基因甘蔗与野生型之间的差异表达蛋白，发现与干旱胁迫相关的蛋白大多数具有酸性跨膜、富含疏水氨基酸、稳定性好的特点。Wu等[47]成功构建了rd29a-dreb-hyg表达载体，该表达载体已成功转导到甘蔗中。总之，有关外源转录因子及蛋白激酶抗旱基因直接转化水稻、玉米等单子叶植物的研究报导比较多，而且取得了成功，转基因植株的抗旱性能有较大提高，但是甘蔗这方面的研究相对较少。

综上所述，在现代分子生物学快速发展的今天，随着生物技术手段及生物信息学的不断完善，人们对植物抗旱分子机理的研究得以深入探讨，在没有甘蔗完整基因组的情况下，随着高通量测序技术的发展与完善，研究者利用该技术挖掘出一批甘蔗抗旱基因，并进行了基因克隆，取得了一定的成果。接下来应在继续挖掘抗旱基因的基础上，开展甘蔗抗旱基因的遗传转化研究，真正地将理论转化为生产力。由于植物抗旱性能是由多个基因控制的数量性状，孤立地针对单一基因研究并不能全面揭示植物抗旱的分子机理，并且单个基因的遗传转化对植物抗旱性的提高也有限，通过探讨多基因共转导对植物抗旱效应的影响，是未来甘蔗转基因工程研究的一个重要发展方向。