Wilms肿瘤基因在生长发育及非肿瘤性疾病中作用研究

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(中南大学湘雅药学院药理学系，湖南 长沙 410008)

Wilms肿瘤基因(Wilms’ tumor gene, WT1)位于染色体11p13处，因首次在儿童肾癌肾母细胞瘤(Wilms肿瘤)中克隆出来而得名[1]。哺乳动物WT1基因长约50 kb，包含10个外显子，其在C端DNA结合区域有4个锌指样结构，是一种锌指样转录因子，具有多种转录特性，可以通过激活或者抑制靶基因影响细胞增殖、生长、凋亡等[2]；此外，WT1能够维持上皮间质转化(EMT )和间质上皮转化(MET)之间的平衡[3]。在哺乳动物体内，WT1基因可以通过转录起始位点、翻译起始位点、选择性剪切和RNA修饰的形式相结合产生36种潜在的亚型，在这36种潜在亚型中，常见亚型有4种：在第3和第4锌指结构之间包含赖氨酸，苏氨酸和丝氨酸(+KTS)和缺少这三种氨基酸(-KTS)这两种亚型，以及在第5外显子区域，通过选择性剪切产生的含中间17个氨基酸(+17AA)和缺少这17个氨基酸(-17AA)两种亚型，分别标记为亚型A(-17AA/-KTS;-/-)、亚型B(+17AA/-KTS;+/-)、亚型C(-17AA/+KTS;-/+)和亚型D(+17AA/+KTS;+/+)[4]。研究报道，WT1这4种亚型的功能可能存在差异[5-6]：例如，在调控三阴性乳腺癌细胞血管生成拟态和转移过程中，亚型B和C过表达细胞系能够明显增强血管生成拟态形成能力，且细胞迁移率更高；在髓性白血病中，亚型D高表达于慢性和急性患者，亚型B在急性患者中表达高于慢性患者，而亚型C则主要在慢性患者中高表达，提示WT1各个亚型有望成为辅助诊断髓性白血病的分子标记。目前有关WT1的研究主要集中在肿瘤方面；近年来研究表明，WT1 基因还参与了生长发育调控及一些非肿瘤性疾病的发生。

1 WT1与生长发育

WT1编码的蛋白对于一些组织器官的发育是必不可少的。在胎儿发育时期，WT1对肾脏、性腺、脾脏等器官的发育至关重要，胚胎小鼠WT1基因敲除可出现肾脏、性腺和脾脏发育缺陷，在发育中期则可因冠状动脉血管发育缺陷而死亡。WT1基因敲除小鼠出生后亦可出现肾小球硬化、胰腺和脾脏萎缩、骨组织和脂肪严重减少以及红细胞生成障碍等[7]。WT1还参与心外膜的分化和再生以及心脏血管形成，在维持心脏正常发育中发挥重要作用。

1.1 WT1和肾脏发育肾脏在发育过程中，可形成前肾、中肾和后肾；前肾和中肾是暂时性的器官，在胚胎发育过程中逐渐退化，后肾则发育成永久性肾脏。功能性肾脏发育主要依赖于后肾基质细胞和来自中胚层的输尿管交互作用。WT1基因首先表达于中胚层，进而表达于各类细胞，调控后肾的发育。肾间质细胞经过间质-上皮转换最终形成肾元，而在逗号小体发育期和S小体发育期，间质细胞中WT1表达水平持续升高。在成熟的肾脏中，WT1的表达局限于肾小球足细胞，调控足细胞的发育，从而维持肾小球滤过屏障完整；成熟足细胞中WT1缺失能够激活足细胞Notch信号，参与肾小球硬化症早期发病过程[8]。研究报道，胰岛素样生长因子结合蛋白5 (IGFBP5) 表达能够调控后肾发育过程中上皮的形成，在后肾原基细胞中与WT1共表达，抑制WT1蛋白的表达能够显著抑制IGFBP5的转录，肾脏形成从而受到严重影响，因此，WT1激活IGFBP5基因的表达可能是肾脏形成过程中重要的调控机制[9]。另外，视黄酸(RA)号对肾脏发育必不可少，RA合成酶ALDH1A1、ALDH1A2 和ALDH1A3在肾器官形成和肾元分化过程中呈现复杂的动态表达模式：在S小体管状结构分化过程和输尿管芽结构发育过程中，可检测到ALDH1A1和ALDH1A3表达，但在足细胞分化阶段并不表达ALDH1A1和ALDH1A3；ALDH1A2主要表达在基质，其在逗号小体近端表达很弱，但在S小体和第三阶段肾元发育期呈一过性高表达，但是在第四期肾元的足细胞中表达急剧下降。WT1能够负向调控ALDH1A1、ALDH1A2 、ALDH1A3，进而参与肾脏发育的整个过程[10]。WT1基因发生突变会影响肾脏的正常发育和功能，可导致各种肾脏疾病，甚至出现终末期肾功能衰竭。

1.2 WT1和心脏发育心脏是胚胎发育过程中第一个形成并发挥功能的器官，负责哺乳动物胚胎中营养和氧气的输送。心外膜经过上皮间质转换产生心血管祖细胞，祖细胞最终分化成冠状动脉平滑肌细胞、内皮细胞、血管周细胞、心脏间质成纤维细胞和心肌细胞等，各细胞间的“对话”对心脏的发育至关重要[11]：例如，在心脏形成过程中，内皮细胞一方面形成血管腔维持心肌细胞的血氧和营养物质供应，另一方面通过自分泌和旁分泌途径与心肌细胞“对话”调节心肌细胞发育与舒缩功能[12]。在胚胎心脏形成过程中，WT1可在心外膜细胞及其衍生细胞如内皮细胞中表达，调控胚胎发育过程上皮间质转化及相关细胞的分化，而敲除WT1能够明显减少心脏间充质干细胞及其衍生细胞生成[13]。在成熟心脏冠状动脉内皮细胞中，存在WT1阳性表达，而WT1基因沉默则能够抑制内皮细胞增殖[14]。在小鼠心肌梗死模型中，心脏内皮细胞中WT1表达一过性上调[15]。WT1基因可通过调控SnaiI、CdhI转录，调控β-catenin和RALDH2 信号通路来参与心外膜内皮间质转化(EMT)，进而来调节心肌细胞生长和冠脉系统形成[16]。上述研究提示，WT1不仅参与了心血管系统的发育成熟，而且对于维持正常心血管功能亦发挥重要作用。

1.3 WT1与间充质干细胞分化分别分离C57雄性小鼠附睾、肠系膜、腹膜后、网膜、心外膜、肾周内脏脂肪组织、腹股沟皮下白色脂肪组织以及棕色脂肪组织进行消化离心，获得具有干细胞特性的基质血管组分(SVF)，利用谱系分析显示，内脏SVF中存在大量WT1阳性细胞，而皮下SVF、棕色SVF以及成熟的脂肪细胞几乎检测不到WT1阳性细胞存在，因此WT1被视为内脏脂肪干细胞的特异性标记之一[17]。在人内脏脂肪干细胞分化过程中，WT1能够促进视黄酸(RA)合成，阻碍内脏脂肪干细胞早期成脂作用[18]。肝脏间充质干细胞(HSCs)亦来源于WT1阳性表达的细胞群，WT1能够直接影响HSCs分化，其机制可能也与肝脏受损后，RA生成增加有关，DNA甲基化是调控多功能干细胞分化的重要机制，WT1能够与甲基胞嘧啶加双氧酶Tet2结合，促进DNA甲基化和转录激活，进而调节HSCs分化[19]。

2 WT1和疾病

WT1基因具有4个C2H2锌指结构，这些特殊的结构区域对多种RNA、DNA和蛋白具有很强的结合能力，从而参与多种生物学过程。该基因突变会改变锌指结构域与RNA、DNA和蛋白的结合能力而导致功能异常，最终参与多种疾病，尤其是肿瘤性疾病的发生发展。有趣的是，随着对WT1基因研究的不断深入，我们发现WT1不仅参与肿瘤的发生发展，其也参与了糖尿病肾病、高血压和肥胖等多种非肿瘤性疾病的发病。

2.1 WT1和肥胖脂质代谢与脂肪细胞分化异常导致能量摄入与消耗不平衡是诱发肥胖的直接原因，而肥胖与高脂血症、高血压、代谢综合征、冠心病、房颤、抑郁等心血管等疾病密切相关[20]，同时也与肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种癌症存在关联[21]。肥胖可以分为由内脏脂肪堆积引起的腹型肥胖和由皮下脂肪堆积引起的周围型肥胖；大量研究表明，内脏脂肪堆积是胰岛素抵抗、糖尿病等代谢性疾病及动脉粥样硬化、高血压等发病的关键因素[22]，而皮下脂肪则可能发挥保护作用：例如，高脂饮食诱导肥胖和2型糖尿病的C57BL/6J雄性 小鼠，在其皮下白色脂肪中组织注射合成的脂肪性“鸡尾酒”(基质凝胶，凝胶微球，和bFGF)以促进脂肪分化，发现注射10周后，小鼠的葡萄糖耐量以及对胰岛素的敏感性得以显著改善[23]；对健康、超重/中度肥胖的成年受试者内脏脂肪组织、皮下脂肪组织进行计算机断层扫描和胰岛素敏感性检测，结果显示内脏脂肪组织比重越高，胰岛敏感性越差，而皮下脂肪组织比重越高则其对胰岛素敏感性越好[24]。皮下脂肪的这种保护作用机制并不太清楚，可能与皮下脂肪库中产热脂肪活性较高有关。哺乳动物体内存在3种不同的脂肪：白色脂肪、米色脂肪与棕色脂肪，白色脂肪以储能为主，棕色脂肪来源于Mfy5+细胞，高表达解偶联蛋白Ucp1，通过解偶联呼吸作用将能量转化为热能；米色脂肪主要存在于皮下白色脂肪库中，是一种新型产热脂肪，基础状态下Ucp1的水平介于白色脂肪与棕色脂肪之间，在冷暴露、β-肾上腺激素受体激动剂、cAMP诱导下，白色脂肪库中米色脂肪活性显著增高，解偶联蛋白Ucp1表达增加，从而发挥耗能产热的功能[25]。研究发现，WT1高表达可促进内脏脂肪干细胞中视黄酸(RA)的生成，从而阻碍早期成脂，发挥抑制白色脂肪的分化作用[26]。2014年， Paul,等研究发现，WT1敲除小鼠的脂肪组织基质血管组分(SVF)中产热脂肪形成相关基因Cidea、Prdm16、Ucp1 mRNA水平显著上调[27]，提示WT1可能参与内脏白色脂肪脂肪向米色脂肪转化调控。

2.2 WT1和高血压众所周知，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高血压等心血管疾病发病中地位重要，血浆高肾素水平可作为高血压的生物学标记之一[28]。研究报道，缺失三个氨基酸的WT1剪切异构体WT1(-KTS) 能够抑制肾素基因的转录，而WT1(-KTS) 发生突变后会导致血浆中肾素水平升高，增加高血压发病风险[29]。研究发现，雄性自发性高血压SHR大鼠出生4周左右便可出现肾小球胶原纤维沉积，肾功能受损，伴随肾皮质WT1表达下调[30]，提示WT1不仅通过调节RAAS参与高血压发病，可能还与高血压肾病等并发症密切相关。内皮细胞维生素D受体(VDR)在维持内皮细胞功能和控制血压中起着重要作用，使用VDR激动剂能够引起血管内皮功能紊乱进而导致高血压等一系列的心血管疾病；VDR基因突变小鼠一氧化氮合成酶(NOS)表达下调，一氧化氮(NO)合成降低，可引起内皮功能紊乱[31]。用cDNA阵列杂交分析发现，VDR是WT1基因的下游基因，人类WT1基因可与VDR启动子结合，从而激活VDR基因表达[32]。

2.3 WT1和糖尿病肾病糖尿病肾病 (diabetic nephropathy，DN) 是一种危害性较大的糖尿病慢性并发症，可出现肾小球肥大/ 硬化、基底膜增厚、间质纤维化等病变，最后引起不同程度的蛋白尿甚至严重的肾功能障碍[33]。在肾脏发育过程中，WT1基因在间质细胞和肾小球上皮细胞表达，能够使间质细胞和肾小球上皮细胞转化为成熟的足细胞，并调控足细胞的增殖与分化。足细胞损伤是糖尿病肾病发病的早期特征，糖尿病肾病患者足细胞数量减少，功能受损；临床上通过WT1免疫染色计算足细胞数，进而根据足细胞的数量诊断糖尿病肾病，因此，WT1阳性表达的足细胞数少于正常水平被认为是足细胞损伤的早期生物标记。研究报道，C-Maf诱导蛋白CMIP在足细胞相关疾病中过度增生，并且能够改变细胞内信号。在生理条件下WT1是CMIP的抑制因子，WT1基因能够与其启动子区域结合进而抑制其转录诱导，从而维护肾脏功能[34]。另外，下调WT1表达能够招募低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP6)激活Wnt/β-catenin 信号通路， 而β-catenin激活能够促进足细胞功能紊乱和细胞凋亡，诱发蛋白尿形成[35]；而且β-catenin可触发泛素介导的WT1蛋白降解，进一步降低WT1水平；而增加WT1表达水平则能够维护足细胞结构的完整性，减少足细胞凋亡和氧化应激损伤，对 β-catenin 诱导的足细胞损伤可发挥保护作用[36]，从而延缓糖尿病肾病进程。

3 展 望

WT1基因具有锌指结构域，可以与DNA、RNA、蛋白结合，从而发挥广泛的生物学作用。既往主要关注的是WT1在肿瘤中的作用，但对其在生理功能调控及及非肿瘤性疾病中的作用及机制并不十分清楚。随着人们生活水平的提高和生活方式的转变，肥胖及相关代谢性疾病已日益成为继肿瘤之后严重危害人类健康的公共卫生问题；WT1是内脏脂肪特异性标记因子之一，其在内脏脂肪干细胞中表达水平较高，但其对内脏脂肪细胞分化与功能是否具有调控作用，以及是否参与肥胖及其相关代谢性疾病的发病，目前知之甚少。深入探讨WT1基因在生长发育和代谢性疾病中的作用及机制，可为代谢性疾病等非肿瘤性疾病的防治提供新的依据。

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