肠道病毒71型非编码区结构与功能研究进展

董祯 温红玲

250012济南,山东大学公共卫生学院微生物检验学系感染性疾病防控重点实验室(山东省“十三五”高校重点实验室)

自1969年在美国加利福尼亚分离出来至今，EV71已在全世界发生过多次暴发和流行，是亚太地区最严重的嗜神经病毒之一。EV71导致的手足口病(hand， foot and mouth disease，HFMD)大部分为自限性疾病，常表现为手足口部位的疱疹，重症患儿可伴有脑炎、脊髓灰质炎样急性迟缓性麻痹、脑干脑炎等神经系统并发症，部分患者出现肺出血、肺水肿甚至心肺衰竭等其他严重的全身性疾病，致残率及病死率较高[1-2]。近年来，EV71发病率仍呈上升趋势，且重症感染较多，对婴幼儿的生命健康造成了严重的威胁[2-3]。EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属A组，为单股正链RNA病毒，基因组长约7 400 bp，两端分别是保守的是5‘UTR和3’UTR，中间是编码一个多聚蛋白的开放阅读框(open reading frame，ORF)。该多聚蛋白在自身蛋白酶的作用下水解为结构和非结构蛋白，在病毒感染过程中发挥各自作用[4]。研究显示EV71的非编码区可以与宿主相互作用，能在病毒RNA合成的起始阶段及蛋白翻译过程中对病毒感染发挥重要的调控作用。因此，研究EV71非编码区结构与功能的关系，对于揭示其致病机理及病毒的生命活动具有重要意义。

1 EV71 5′非编码区结构及功能

1.1 5′UTR结构 EV71的5′UTR是病毒基因组较为保守的区域，能折叠成复杂的二级结构，主要由6个茎环结构(stem-loop，SL)构成。临近5′末端的茎环Ⅰ是三叶草样结构(cloverleaf)，能与宿主蛋白发生相互作用，参与调控RNA的复制及合成，并且与维持病毒基因组结构的稳定性有关[5]。SLIISLVI共同组成内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，以不依赖帽子结构的方式与宿主细胞核糖体结合从而在病毒进入细胞后启动病毒基因组的翻译，并通过宿主因子调控病毒RNA的翻译效率[6]。IRES中的SLIII和SLIV是相对保守的区域，SLII，SLV和SLVI则具有多变性，可能影响病毒毒力[7]。茎环结构内部含有三个C-rich区，一个在SLII之前，另外两个位于SLIV中。在SLV的下游还有一个富嘧啶(pyrimidine-rich)区，富嘧啶区的下游有一个沉默密码子AUG，不能启动高效率的翻译，而真正的翻译起始位点AUG位于其下游约150 bp处[8]。目前，在IRES的SLVI和第一个AUG密码子之间没有预测到RNA二级结构，该区域被定义为“连接区”[9]。连接区可能通过与宿主蛋白相互作用调节IRES的活性进而调控病毒翻译过程，但具体机制仍然未知。

1.2 5′UTR功能研究 小RNA病毒的IRES被分为4种类型，主要取决于它们需要辅助宿主蛋白在内部招募核糖体的程度。EV71的IRES已被证明在功能上类似于Ⅰ型IRES，能与多种宿主蛋白相互作用，对病毒的复制和翻译至关重要[10]。远端上游结合蛋白1(FBP1)通过正调节IRES活性可作为病毒翻译的正调控因子，而最新研究表明远端上游结合蛋白3(FBP3)能够通过结合EV71 5′UTR作为IRES相关作用因子(ITAF)并负调节病毒翻译[6，9]。poly(C)结合蛋白1(PCBP1)通过与5′UTR相互作用正向调节EV71复制，其中SLI和SLIV空间结构对PCBP1与病毒RNA结合尤为重要，可能影响病毒复制能力[11]。此外，异源核糖核蛋白(hnRNP)家族的成员，例如，聚嘧啶结合蛋白(PTB)，poly(C)结合蛋白2(PCBP2)，富含 AU的元件结合因子1(AUF1)等均被发现充当ITAF，通过与5′UTR不同区域结合直接调节IRES活性，但具体机制有待进一步研究[9，12]。

研究表明5′UTR某些位点突变可能使病毒复制能力、嗜神经性甚至毒力发生一定的变化。Ma等[13]通过比较置换了5′UTR的EV71重组病毒与原病毒的生长曲线后发现，5′UTR能够影响EV71复制能力且高温下病毒复制能力有所下降，这提示可能存在EV71毒力位点或者高温敏感位点。Yeh等[14]在EV71基因组的5′UTR的第158位点处进行点突变(C158U)后发现病毒复制能力降低，进一步通过ICR小鼠实验发现病毒致病力减弱，这说明C158位点是EV71的毒力决定位点。张慧娟等[15]通过多个病毒序列比对发现，在5′UTR区中第254位碱基的突变(A254G)可能与EV71感染后引起的不同临床症状有关。袁晓晶等[16]通过对EV71不同表型毒株基因组序列比对发现，分离自中枢神经系统(CNS)累及的6个病毒株在5′UTR区第265 nt、703 nt两处均发生了变异(G265A，G703T)，而轻症HFMD来源的病毒株在该位点未发生变异。这些研究说明5′UTR某些位点突变能够引起不同临床结局，可能与EV71的致神经毒性作用有关，可作为潜在的毒力位点进一步研究。

Wen等[16]通过基因序列对比发现EV71轻症株和重症株5′UTR之间的二级结构具有明显区别。Li等[17]比对25株EV71重症分离株与31株轻症株的序列发现5′UTR内3处碱基位置上的核苷酸(nt272G，nt488U，nt700 A/U)发生了一致性改变，二级结构分析显示nt488U突变引起SLIII的稳定性发生改变，进而导致病毒毒力变化引起不同表现型。Kok等[18]将 EV71的 5′UTR替换成鼻病毒(rhinovirus)的5′UTR后发现病毒复制能力变弱，然而多次细胞传代后恢复了亲本的复制能力，分析其二级结构认为U461C突变增加了SLV区域GC配对含量，使二级结构更稳定，从而提高了翻译效率使得病毒复制增强。Jia等对EV71强毒株的IRES二级结构预测表明，GP114→CP114和GP151→TP151突变有助于在SLII中形成独特的RNA二级结构，可能导致病毒毒力增强[19]。最新研究表明，SLII内部堆叠形成保守的5′-AUAGC-3′凸环结构是病毒翻译和复制的关键决定因素，当内部碱基突变后病毒复制能力降低，删除凸环结构则病毒完全失去感染RD细胞的能力[20]。人异源核糖核蛋白(hnRNP A1)与SLII相互作用形成特异性复合物，SLII凸环等结构突变能改变复合物的稳定性，严重影响病毒翻译和复制能力[21]。另有研究初步表明，从重症以及死亡患者分离出的EV71毒株的5′UTR RNA二级结构比轻症毒株的二级结构更加复杂和紧凑，尤其是在IRES的SLIV区，且重症株有比轻症株具有更多茎环结构[22]。目前对EV71复制能力及毒力与5′UTR二级结构改变的关系研究逐渐增多，但由于其序列复杂且结构具有高度灵活性，其三维结构仍然未知，今后对空间三维折叠构象的深入分析是必不可少的一方面。

研究发现位于三叶草结构与SLII之间的非茎环结构区内第104位碱基是柯萨奇病毒16型(CA16)的毒力决定位点，与病毒复制有关并且影响由IRES介导的翻译活性[23]。同一区域内，脊髓灰质炎病毒(poliovirus，PV)第103位碱基由A突变为C后病毒的毒力发生衰减，并且丧失了在神经细胞上的温度敏感表型[24]。另有研究者发现，在三叶草结构与IRES之间的部分碱基与三叶草结构之间存在协同作用，通过增加宿主蛋白结合的能力调节病毒复制[25]。另外，对于连接区研究较少，目前认为连接区可以促进IRES三级结构的形成，对病毒构象有重要意义，该区域的变异可能对毒力也有一定影响。这提示我们不能忽略对IRES以外的其他区域的碱基突变和空间结构的关注。

2 EV71 3′非编码区结构及功能

2.1 3‘UTR结构 EV71的3’UTR也是高度保守的非编码区的一部分，它具有多种高度复杂的空间结构，此区域可能包含病毒基因组复制的调控位点。3′UTR的核心结构是由碱基互补配对折叠形成的两个茎环结构域(stem-loop domains，SLDs)，分别称为X和Y。这两个结构域的长度是保守的，分别由8个碱基对和12个碱基对组成。3′UTR一端由遗传编码的poly(A)尾部组成，其部分包含在结构域X的茎中[26]。X和Y结构域的环区与环外的碱基配对可进一步形成互补假结体，把这种能相互作用并且类似“吻型”(kissing interaction)的高级结构命名为结构域K。结构域K的稳定性不高，常以变换折叠的不同结构存在。近期研究发现，3′UTR除了X和Y两个茎环外还具有特殊的“Z型”结构域(SLDZ)。根据核苷酸序列的长短分为两组，EV71 B3和C4亚型与 CVA4，CVA14和 CVA16等携带Ⅰ组SLD-Z，EV71原型株BrCr与其余亚型都携带Ⅱ组SLD-Z。实验数据表明，SLD-Z是EV71和A型柯萨奇病毒16(CVA16)进化重组的标记[18，27]。值得一提的是，SLD Z的缺失能够导致病毒在神经元细胞(SH-SY5Y)的特异性生长缺陷，很可能与神经毒力有关[28]。“Z型”结构域在病毒的复制过程中也可能发挥其他作用，但目前未见报道。

2.2 3′UTR功能及探究 目前研究认为，3′UTR可能与病毒的进化和适应存在一定关联，部分序列结构缺失可能导致病毒感染性降低[29]。Kok等[18]删除EV71和鼻病毒2嵌合体的3′UTR的17个碱基后，病毒的生长能力大幅度下降。Brown等[30]构建了删除鼻病毒和PV的3′UTR的缺失突变体，然后用突变体感染Hela细胞，结果表明缺失突变体感染HeLa细胞的能力降低，细胞出现病变的时间推迟[30]。

作为非编码区的一部分，3′UTR二级结构对RNA的起始要比碱基组成对于RNA的起始更为重要，增加二级结构稳定性可以提高翻译中涉及的蛋白质的结合，这又可以提高翻译效率。有研究发现，结构域K内个别碱基错配造成的扭曲能导致病毒对温度敏感甚至死亡，如果结构域K中一条链被互补相似物取代则病毒复制被阻断[31]。这种特殊的结构域K可能为翻译起始因子和核糖体相互识别提供了结合位点，也可能激活IRES活性进而影响病毒翻译过程，对EV71结构域K的功能研究需要找到特定作用位点再联合其三维结构进一步分析。目前，对3′UTR结构和功能的研究还处于起步阶段，常用手段就是结构预测后进行突变分析。但是对3′UTR功能的剖析常常受到病毒复制过程中各种因素的阻碍，我们需要通过进一步研究来明确EV71与宿主的相互作用及其空间构象变化对病毒的影响机制。

3 小结

在过去的几十年里，国内外学者对小RNA病毒基因组非编码区的结构和功能进行了大量研究，其研究成果对我们了解EV71病毒基因组的复制，蛋白翻译及病毒包装释放等生命过程具有重要意义。EV71高度保守且空间结构复杂的非编码区在入侵宿主细胞后的翻译及复制过程中的作用不可或缺的，能直接或间接影响病毒的毒力和感染力。随着对EV71研究的逐渐广泛深入和研究技术的日益发展，非编码区的功能及分子机制将逐步揭示。

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