海蜇胶原蛋白保湿霜的研制

郑永军，杜国丰，刘辰锶，任 毅，周雪健，柳琳璇，李慧晗

(营口理工学院，辽宁 营口 115014)

海蜇(拉丁名: Rhopilema esculentu)是一种生活在海洋中的无脊椎软体动物，在辽东湾河口地区有可观的捕捞资源。海蜇既是一种高蛋白低脂肪食品，也是一味中药材，在食品及医药等领域具有巨大的开发前景。新鲜海蜇含水率大约96%，是地球上含水量最高的生物，具有神奇的保水、保湿功能[1]。本文以营口地区丰富的海蜇资源为原料，采用现代分离技术提取海蜇中高性能保湿功能成分，并将其开发成高端天然保湿功能化妆品，不仅可以提高海蜇产品的科技含量和附加值，而且拓宽了海蜇功能成分的应用领域，拉长了海蜇产业链条，有重要学术价值和广阔应用前景，对于辽宁省海洋资源的开发利用具有十分重要的现实意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器

BILON92-IID型超声波细胞破碎仪(深圳市天章机械设备有限公司)；TDL-40B型低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；HH-G型数显恒温水水浴锅(国华电器有限公司)；JYL-C022E型料理机(九阳股份有限公司)；GZX-9023MBE型数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；旋转蒸发仪器(上海亚荣生化仪器厂)；PHS-3C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司)； DP-SAII-2型实验室乳化机(北京亚欧德鹏科技有限公司)多功能数字皮肤测试仪(北京伊丽美科技有限公司)

1.2 材料和试剂

盐渍海蜇皮购于营口市水产批发市场。其他试剂为国产，分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 超声波辅助提取海蜇胶原蛋白

(1)脱盐处理：将从市场上采购的盐渍海蜇皮，先用自来水清洗3遍，然后放入水池用流水浸泡12h，再用去离子水浸泡12 h，进行脱盐处理，并用蒸馏水重复清洗至没有氯离子为止。

(2)粉碎处理：将脱盐处理后的海蜇皮，用不锈钢剪刀剪成小块。取一定量的海蜇皮，加入质量浓度为167g/L的柠檬酸50ml浸泡3h，加入6倍蒸馏水，用JYL-C022E型料理机捣碎匀浆15min，然后将粉碎好的料液冷藏12h。

(3)超声波辅助提取：在一定的实验温度条件下，将料液放入BILON92-IID型超声波细胞破碎仪中，持续30min。

(4)离心分离：将超声波处理后的料液，放入4000rpm高速离心机中，离心20min，分离出上清液海蜇胶原蛋白制品。

1.3.2 海蜇胶原蛋白成分的测定

(1)海蜇提取物水分的测定：准确称取一定量的海蜇胶原蛋白提取液，放入恒温干燥箱中，在105℃下烘干3小时后取出，放入玻璃干燥器中冷却并称重，再把样品放入干燥箱烘干0.5h，直至前后两次的重量差不超过0.002g，按固形物含量(%)(X)公式(1)计算。水分含量(%)=1-X。

(1)

式中：m1——恒重后称量皿重量，g；

m2—恒重后称量皿和样品重量，g；

W——样品重量，g。

(2)海蜇提取物蛋白质含量的测定：海蜇提取物中蛋白质的含量，采用凯氏定氮法(GB 5009.5-2010)测定[2]。

(3)海蜇提取物中脂肪含量的测定[3]：首先，切碎原材料，各称10g放入烧杯中，依次加入甲醇60mL，氯仿30mL并依次搅拌2min，1min；然后将混合物用匀浆机匀浆，用氯仿洗匀浆杯，用量为30mL，之后将洗液与匀浆液混合，搅拌均匀后静置 2min，然后进行抽滤，再用 60ml 氯仿洗滤纸、残渣和容器之后再抽滤，最后将上述滤液合并至分液漏斗中，加入0.5%醋酸锌35mL后振荡摇匀，静置过夜分层。收集氯仿层，用无水NaSO4进行脱水处理，过滤后控温45℃真空旋干，旋蒸瓶底部残余物即为总脂肪。用氮气吹旋蒸瓶至恒重，计算总脂肪重量。

(4)海蜇提取物中灰分的测定：将一定量的海蜇胶原蛋白提取液，放在水浴锅上蒸干。将蒸干后的试样先在电热板上炭化至无烟，然后置于高温电炉内，控温550℃灼烧4h，冷却后取出放入干燥器中冷却30min，重复烧至恒重(前后两次称量相差不超过0.5mg)，按公式(2)计算。

(2)

式中：m1——坩埚和灰分的质量，g；

m2——坩埚的质量，g；

m3——坩埚和试样的质量，g。

1.3.3 海蜇胶原蛋白稳定性检测

将海蜇胶原蛋白提取液，室温下其质量浓度为10mg/mL，pH值=4.0，电导率为1770us·cm-1，吸光度(OD220)为2.223，黏度为124mPa·S。

1.3.3．1 热稳定性实验

分别将海蜇胶原蛋白提取液放置于4℃、25℃、40℃，4℃和40℃冷热交替(每24h交替一次，持续1月)，放置结束后恢复到25℃时检测蛋白质溶液的电导率、吸光度(OD220)和黏度等指标，判断其在不同温度下的热稳定性及产品的储存稳定性，以便于推测其保质期。

1.3.3．2 酸碱稳定性实验

在25℃下，通过加入醋酸溶液或NaOH溶液将海蜇胶原蛋白提取液pH值调节至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，分别测定不同pH值条件下海蜇胶原蛋白提取液的电导率、吸光度(OD220)和黏度等各项理化指标，从而判断其酸碱稳定性。

1.3.4 海蜇胶原蛋白保湿霜的制备

首先水相和油相分别加热到一定温度并维持该温度一段时间，然后将两相慢慢混合到一起，一边混合一边以一定的速度搅拌，直至室温变相成膏体，再用水浴加热一段时间，在适宜的温度下加入适量的海蜇胶原蛋白提取液和香料，再在室温下继续搅拌直到成膏停止搅拌。经实验确定海蜇胶原蛋白保湿霜的配方和最佳的工艺条件。

1.3.5 海蜇胶原蛋白保湿霜的功效检测

1.3.5.1 干燥器法检测定胶原蛋白保湿性能

将冰箱内的海蜇胶原蛋白取出，在室温下放置2h，备用。室温下精确称取海蜇胶原蛋白、15%甘油、大宝SOD蜜乳液各2份，每份10.0g，分别加入称量瓶中。将一组样品放入预先装有饱和碳酸钠溶液的干燥器内(相对湿度RH=43%)，控制时间为12h、24h、48h，分别称量放置前水分量W0，样品控制计时后的水分量Wn，根据公式(3)计算保湿率R。，另一组样品放入硅胶干燥器内作为参比。

(3)

1.3.5.2 人体皮肤保湿功效测试

实验测试条件：温度25℃，时间2h。经过简单培训的健康大学生志愿受试者20名(男、女各10名) ，年龄22～24周岁。对受试者的要求：无系统性疾患史，皮肤健康受试部位皮肤无异常，未涂抹任何化妆品或外用药物。分别在每位志愿者的左、右手臂内侧划定区域标记受测部位(2cm ×2 cm ) ，同一手臂可同时标记多个区域(间隔1cm) ，测试样品和空白对照均随机分布在左、右手臂上。每个受测部位涂抹0.05 mL样品，涂抹后采用数字皮肤水分检测仪分别测量受试样品区域和空白区域皮肤水分含量，每次测试隔10min。

2 结果与讨论

2.1 工艺流程

海蜇胶原蛋白的提取及保湿功效研究工艺流程如图1所示。

图1 工艺流程示意图

2.2 海蜇胶原蛋白提取工艺的优化

目前胶原蛋白的提取方法主要有酸法提取、碱法提取、酶法提取和中性盐法提取等，其中酸法浸提是海蜇胶原蛋白常用的提取方法，但是单纯使用酸法浸提技术，海蜇胶原蛋白提取率并不高[4]。超声波提取法的原理是：采用超声波辅助溶剂，利用超声波产生的高速、剧烈的空化效应和搅拌作用，使海蜇细胞破碎，使溶剂渗透到细胞中，缩短提取时间，提高提取率，被广泛应用于天然产物的提取中。因此本论文采用超声辅助酸法提取工艺，研究了酸浓度、提取温度、提取时间等因素对海蜇胶原蛋白提取率的影响。

2.2.1 浸提液的酸度对海蜇胶原蛋白提取率的影响

酸法浸提的原理是，在酸性条件下海蜇组织蛋白分子和Schiff碱之间的盐键受到破坏，引起组织蛋白的膨胀、溶解，从而被提取出来。盐酸、醋酸和柠檬酸溶液是常用的浸提液。本实用采用柠檬酸溶液作为浸提液，固定其他条件，单纯改变浸提液中柠檬酸的浓度，考察酸浓度对海蜇胶原蛋白提取率的影响。实验结果见图2。

图2 柠檬酸的浓度对海蜇胶原蛋白提取率的影响

图2结果表明，海蜇胶原蛋白的提取率，随着柠檬酸浓度的增加而提高。当柠檬酸浓度超过0.5mol/L后，提取率变化趋缓。考虑提取成本和后续脱酸处理等因素，最终确定浸提液的柠檬酸浓度为0.5mol/L。

2.2.2 提取温度对海蜇胶原蛋白提取率的影响

由于海洋来源的胶原蛋白具有热致变性的特性，当高于其热变性温度时，胶原蛋白的某些性质会发生明显改变。变性后的蛋白质结构发生变化，导致蛋白质的溶解度降低，生物活性丧失。使用超声波辅助提取技术，会使提取液的温度升高。海蜇胶原蛋白为水产品蛋白，其热变性温度较低，在提取过程中如果不控制浸提液的温度，将导致蛋白失去应用价值。

固定其他条件，在不同温度条件下，用目测法观察胶原蛋白的变性温度，发现当浸提液超过57℃时，胶体状的溶液就会发生蛋白质析出现象，这是胶原蛋白变性所导致的。为避免使用超声波导致浸提液温度升高，最终采用将浸提液预冷却的方法，控制温度不超过40℃为宜。

2.2.3 提取时间对海蜇胶原蛋白提取率的影响

固定其他条件，改变超声波处理时间，实验结果见图3。

图3 超声处理时间对海蜇胶原蛋白提取率的影响

从图3结果看出，超声波处理时间过25min，海蜇胶原蛋白的提取率增加趋势变缓，超声波处理时间最终确定为25min。

2.2.4 海蜇胶原蛋白的性能指标

采用优化后的提取工艺，提取得到的海蜇胶原蛋白产品主要指标见表1。

表1 海蜇胶原蛋白提取物主要成分指标

2.3 海蜇胶原蛋白稳定性实验

2.3.1 酸碱稳定性实验

按照1.3.3将固体物含量10%的海蜇胶原蛋白提取液，在不同pH条件下测试其电导率、吸光度(OD220)和黏度，结果如表2所示。

表2 海蜇胶原蛋白提取物酸碱稳定性实验

由表2可知，改变海蜇胶原蛋白提取液的pH值，由于离子浓度的改变导致电导率发生一些微小变化。虽然在碱性条件下，提取液的吸光度有所增大，但肉眼基本观察不出显著变化。综合各项数据，表明海蜇胶原蛋白提取液在pH值=3～10范围内，酸碱稳定性非常好，可以适用于各种pH条件的化妆品中。

2.3.2 热稳定性实验

按照1.3.3对海蜇胶原蛋白提取液进行热稳定性测试，实验结果如表3所示。

表3 海蜇胶原蛋白提取液热稳定性测结果

由表3可知，在海蜇胶原蛋白热变性临界温度以下，电导率、吸光度(OD220)和黏度三项参数变化非常小，表明可在较大温度范围内使用。

2.4 海蜇胶原蛋白保湿霜的基本配方

经实验确定的海蜇胶原蛋白保湿霜基本配方如表4所示。

表4 海蜇胶原蛋白保湿霜基本配方

表4(续)

2.5 海蜇胶原蛋白保湿功能评价

2.5.1 干燥器法检测定胶原蛋白保湿性能

以15%甘油、大宝SOD蜜乳液为参比，采用对比法，对分离提纯的海蜇胶原蛋白成分进行干燥器法保湿性能试验，试验结果见表5。

表5 三种样品的保湿率

结果表明，我们所提取的海蜇胶原蛋白，其保湿率优于15%甘油和市售品牌化妆品“大宝”牌SOD蜜。

2.5.2 人体皮肤保湿功效评价

以为添加海蜇胶原蛋白的保湿霜为对照霜、市售保湿霜类著名品牌产品大宝SOD蜜乳液为参比，采用对比法，对所研制的海蜇胶原蛋白保湿霜样品进行人体皮肤保湿性能试验，结果如图4所示。

▲-海蜇胶原蛋白保湿霜； ■-大宝SOD蜜； ▼-空白对照霜样图4 人体皮肤保湿功效测试

海蜇胶原蛋白保湿霜样品经20名受试者现场测试，考察其保湿效果，并与品牌产品进行对比试验。结果表明，该产品可与名牌产品相媲美，其保湿效果优于空白对照霜样品和市售品牌化妆品"大宝"牌SOD蜜。

3 结论

研究了海蜇胶原蛋白的提取工艺，为下一步规模化提取提供了技术依据。研究了海蜇胶原蛋白提取液的稳定性和保湿功效，实验结果表明，所提取的海蜇胶原蛋白酸碱稳定性和热稳定性好，具有优良的保湿功效，其保湿效果优于空白对照霜样品和市售品牌化妆品“大宝”牌SOD蜜，能够作为保湿剂添加到化妆品中。

[1]金桂芬. 海蜇胶原蛋白提取及超滤在胶原蛋白纯化中的应用[D].浙江:浙江工业大学,2008.

[2] 中华人民共和国卫生部.GB 5009. 5-2010,食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京： 中国标准出版社，2010.

[3] Folch J,Lees M,Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J].J Biol Chem,1957,226:497-509.

[4] 庄永亮. 海蜇胶原蛋白理化性质及其胶原肽的护肤活性研究[D].山东:中国海洋大学,2009.