梅毒疫苗发展面临的挑战与机遇

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(1.南华大学病原生物学研究所，湖南 衡阳421001；2.常德市第一人民医院检验科；3.南华大学衡阳医学院2015级临床医学4班；4.湘南学院预防医学与检验医学系)

梅毒是由苍白密螺旋体苍白亚种(Treponema pallidum subspecies pallidum，Tp)感染引起的一种全球广泛流行的性传播疾病，主要发生在包括中国在内的中低收入国家，但在高收入国家中梅毒也再次出现并迅速回升，尤其在男-男性行为者(MSM)和孕妇中呈急剧上升态势。先天性梅毒成为当前死产的主要原因[1-2]，梅毒患者感染和传播AIDS的风险也大大增加，梅毒感染使全球经济蒙受巨大损失。控制梅毒不能仅靠现有的筛查和治疗手段，必须寻求新的附加措施，而开发梅毒疫苗就是其中之一[3-4]。有效的梅毒疫苗将克服如今面临的诸多困难[3]：预防Tp感染，进而预防各期梅毒发展及母婴垂直传播；预防不同Tp临床株的交叉感染，相应地减少再感染的发生率；无需依赖复诊和青霉素的充足供应即可有效控制梅毒。研发疫苗不但对消灭梅毒具有重要意义，而且能有效降低AIDS发生[4]。

1 梅毒疫苗前期研究状况

与其它病原体的疫苗开发相比，有关梅毒疫苗的实验研究非常有限，主要原因是：Tp的生物学性状特殊[2]：外膜蛋白(OMP，为主要疫苗靶分子)稀少；外膜脆弱使OMP难以鉴定；不能体外培养，体内增殖缓慢；不能通过基因操控来研究基因功能；细胞壁缺乏革兰阴性菌共有的脂多糖；不产生明显毒力因子。此外，缺乏从事Tp基础研究的科研人员、Tp研究领域相对于其他病原体较落后的方法学[5]也是重要影响因素。

早在上世纪六七十年代，Metzger 和Miller 分别用4 ℃短期储存后致弱的Tp和γ射线致弱的Tp(Nichols株)免疫家兔后分别获得了针对Nichols株攻击的部分和完全保护，通过比较得出结论[3]：表面抗原是梅毒疫苗的关键成分，但对热敏感；保护性免疫是逐步诱导形成的；不同Tp株的保护性抗原不同；在兔模型中可诱导出持久和无菌免疫保护。

早期应用全细胞免疫虽能获得完全保护，但因免疫剂量大和免疫时间长，不适合应用于人体，却为发展梅毒疫苗提供了可行性和实验依据。随着Tp基因组解析和基因工程技术的开展，国外以重组蛋白类型[3,5]，国内以核酸疫苗类型[6]，先后在动物模型中对单个抗原测试了免疫保护力，包括Tp92 (BamA) 、TprK、TprI、TprF 、Gpd、TmpB、TpN15、TpN47 、Tp0155、Tp0483、 Tp0956、4D、内鞭毛和Tp0751[7]。其中用Tp92 (BamA) 、4D、Gpd、TpF和内鞭毛免疫的家兔损害发展减弱，显示出部分保护；用抗原可变的TprK获得了很有希望的部分保护，该分子的保护性结构位于蛋白N末端区域[3]；最近，以重组Tp0751蛋白免疫兔，发现其器官的Tp负荷明显减低，而以Tp攻击Tp0751免疫兔后，将其淋巴结引入其他兔体内未出现感染，表现为无菌免疫，提示Tp0751是非常有希望的候选疫苗分子[7]。然而，TprK 、Gpd 和Tp92(BamA) 这几种蛋白保护力的研究结果有分歧[3]。 以上研究表明：抗Tp感染保护不是由单一Tp抗原提供的，应发展多价疫苗；不同实验室间结果不同，突显了对实验室间抗原制备和免疫方法实行标准化的重要性。

在梅毒临床前开发疫苗方法学方面，一个重大进步是应用实时定量PCR(qPCR),该技术可以在家兔感染Tp的远端部位对Tp-DNA进行灵敏的定量检测[8]，但无法区分Tp死活，也很难从复杂组织中(如淋巴结)有效提取DNA。荧光原位杂交(FISH) 应用一个可识别Tp 16s rRNA的种特异性探针，能对人和兔组织样本中的Tp进行定位分析[9]，提供更多信息。

2 梅毒疫苗成功接种需要的相关免疫保护因素

强烈的迟发型超敏反应(DTH)对有效清除损害部位的Tp至关重要[10]。通过CD4+Th1细胞、NK细胞、CD8+CTL等局部分泌的Th1型细胞因子(如IFN-γ)活化巨噬细胞，促进其吞噬被特异性抗体调理的Tp，被认为是清除Tp的主要机制。

除细胞免疫应答外，体液免疫应答也是必不可少的。然而抗体调理巨噬细胞吞噬进程缓慢，且某些Tp亚群可以逃避调理吞噬作用，这些持续存在的亚群可能对调理素(抗体)敏感性不同，这与表面抗原暴露的差异性或抗原变异有关[3]。Tp亚群的免疫逃避使目前的疫苗方案难以完全抵抗Tp感染，这对发展梅毒疫苗是一个巨大挑战。

基于对Tp免疫清除机制的认识，临床前疫苗研究应着重于促进Th1型细胞因子产生，因其能激活巨噬细胞和促进Tp的调理吞噬。此外，有效免疫还需针对那些能抗巨噬细胞清除而持续存在的Tp种群和血管内的Tp，以抑制Tp向感染远端播散。

3 对HIV阳性者梅毒防护相关因素的再思考

HIV和Tp混合感染导致HIV载量增加，并增加HIV传播风险。Tp感染时，主要依赖CD4+T细胞活化的DTH对清除病变部位Tp至关重要，但HIV可破坏感染者的CD4+Th细胞致其数量偏低。在HIV阳性者的硬下疳部位，CD8+T细胞替代耗竭的CD4+Th细胞而成为主要淋巴细胞，产生IFN-γ等细胞因子，活化硬下疳部位的巨噬细胞。此外，HIV阳性者的CD4+Th2细胞受损，B细胞缺乏其辅助使血清中特异性抗Tp抗体活性较低[11]，不利于病变部位Tp清除。了解HIV阳性者体内这一免疫应答变化特点和代偿清除机制，对于开发梅毒疫苗去保护这一最重要的目标人群至关重要。此类疫苗接种应能促进包括CD8+T细胞和NK细胞等免疫细胞产生Th1型细胞因子。然而，在为HIV阳性者开发有效疫苗之前，还需更好理解HIV阳性者体内调理素应答的变化，以及CD8+T细胞和NK细胞在梅毒损伤中的作用。

4 梅毒疫苗设计应考虑的关键问题

成功的梅毒疫苗需要考虑四个方面[3]：在感染部位形成的高度传染性的硬下疳；Tp的高度侵袭力；Tp的重复感染能力；Tp逃避强烈免疫应答清除的能力。因此，有效的梅毒疫苗应能防止梅毒硬下疳的发展、梅毒的传播、梅毒的持续感染和再感染[3]，以消除感染者症状和疾病在总人口中的传播。如上所述，Tpr蛋白家族中的某些蛋白免疫新西兰兔后能减缓硬下疳的发展，预测这些蛋白亚家族成员暴露在Tp表面[3,12]，在预测的表面暴露环状区域出现广泛的序列变异[13]，表明其在Tp持续感染和再感染中也发挥作用。关于Tp高度侵袭力，已证明Tp0751是一种对细胞外基质(ECM)和细胞均具有黏附作用的黏附素，提示Tp通过其经血液播散[14]。其他已发现的黏附素包括Tp0136[15]、Tp0155[16]、Tp0483[16]、Tp0750[17]和Tp0435[18]，可能在Tp播散中起相似作用。由于在Tp感染时发病机制复杂，很可能需要多种Tp抗原的混合物接种以获得完全保护，因此上述致病因子可能是多价疫苗的候选分子。

梅毒临床前疫苗开发过程中需要评估几个关键问题，包括为获得最大免疫力所需要接种次数，疫苗接种后诱导免疫持续时间，对不同菌株的交叉保护，合适的多价疫苗的制备，佐剂的选择与优化等等，以获得免疫应答有效保护机体抗Tp感染。

5 未来发展梅毒疫苗的策略与措施

首先需得到政府有关部门的重视和资金投入，吸引大量的研究人员从事梅毒基础研究，以提供新的思路和跨学科的研究方法，尤其在宿主-病原体相互作用、Tp基础生物学和动物模型的研究领域。其次，应用反向疫苗学和现代研究手段(包括先进的结构方法学与蛋白质组方法学)开展Tp基础生物学研究，鉴定与病原体-宿主间相互作用和致病有关的重要抗原[19]，进而筛选新的疫苗候选分子；同时应用其他病原体研究先进的疫苗方法学，从维持抗原分子天然构象(如采用核酸疫苗形式)、疫苗分子间协同效应、佐剂(如菌影[20])、免疫策略(初免-加免)、免疫途径(改变免疫应答类型)等方面进行选择和优化[5]，进而发展多价疫苗，诱导系统和局部黏膜产生持久的细胞免疫和体液免疫应答以有效保护机体抗Tp感染。此外，还需发展检测家兔种属特异性的免疫试剂，如各类细胞因子检测试剂；建立Tp抗原制备和接种与攻击感染标准化操作程序以减少或消除实验室间的误差[3]。

梅毒疫苗的发展需要专用资金来评估当前和未来的候选疫苗。为确保成功，政府和监管机构应优先考虑发展梅毒疫苗，同时资助机构、非营利和慈善组织及行业合作伙伴给予支持，特别是行业合作伙伴需要获得担保以生产和销售梅毒疫苗。有理由相信，在持续资助和研究人员共同努力下，预期在10年时间内可望获得用于临床的梅毒候选疫苗。