中草药黄酮类提取物对白癜风抗氧化应激作用机制的研究进展

雷杰豪，许爱娥

（浙江中医药大学附属第三医院，浙江杭州310009）

白癜风是一种皮肤科常见色素脱失性疾病，临床上以黑素细胞破坏，黑素小体缺失而出现皮肤白斑为主要特征。氧化应激在白癜风发生发展中扮演着重要角色，降低白癜风患者体内氧化应激水平为临床上白癜风治疗靶点之一，越来越多的研究者致力于针对皮肤抗氧化应激药物的研究。黄酮类化合物抗氧化应激作用在人神经系统、心血管系统已有较深入研究；其在皮肤细胞中抗氧化应激作用研究尚较薄弱，因其潜在的临床药用价值，越来越多学者致力于该方向研究。本文以氧化应激为着重点，总结了8种中草药黄酮类提取物在皮肤细胞中抗氧化应激的作用机制，以期有助于白癜风临床治疗。

1 白癜风氧化应激学说

许多研究证据表明氧化应激在白癜风的发生和发展中扮演了重要的角色，白癜风患者表皮存在高浓度的活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS），主要为H2O2和过氧亚硝基；同时患者体内还可检测到系统性的氧化应激失调，进展期患者表现更为明显[1]。Nrf2-ARE通路及其下游目标基因血红素氧合酶（HO-1）、NADP（H）醌氧化还原酶（NOQ1）、谷胱甘肽转移酶（GST）及谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）蛋白产物是人体内主要的抗氧化途径，有助于ROS的清除，白癜风患者Nrf2-ARE通路功能低下，进一步加剧了氧化应激失调[2]。高氧化应激状态下黑素细胞内部分子结构改变，作为新抗原，诱发免疫反应，进而诱导黑素细胞凋亡，导致皮肤色素脱失[3]。

2 黄酮类提取物在表皮细胞中抗氧化作用

黄酮类化合物广泛存在于自然界植物，目前已有超过8 000多种黄酮类化合物被人类认知，其具有多种生物学活性，包括抗炎、抗癌、抗氧化等。黄酮类化合物主要分为5大类：黄酮、黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、异黄酮和花青素；其主要核心骨干黄烷结构相同，侧链和羟基的位置不同，使他们有着不同的化学性质。黄酮类化合物抗氧化应激作用在多种皮肤疾病中具有潜在应用价值，包括白癜风、黑素细胞瘤等，本文主要总结了目前已研究证实的8种中草药黄酮类提取物在人表皮细胞中抗氧化应激作用的具体机制，包括表没食子儿茶素没食子酸酯、黄芩素、芹黄素、槲皮素、山奈酚、芦丁、非瑟酮、阿福豆甙，以期探索其在白癜风治疗中潜在的应用价值。黄酮类化合物在表皮细胞中的抗氧化作用尚需进一步实验阐明，但可以总结为3大类：①通过羟基结构直接清除ROS；②鳌合金属离子，减少ROS产生；③调节抗氧化系统，重新建立细胞内氧化应激平衡[4]。

2.1 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG） EGCG是绿茶中儿茶素类物质发挥生物学活性最主要的成分，属黄烷醇类化合物，强大的抗氧化、清除氧自由基的能力对多种疾病均有较好效果，如神经系统疾病、动脉粥样硬化等。在皮肤HaCaT细胞中，EGCG可呈浓度依赖性通过转录激活增加抗氧化基因HO-1表达发挥抗X射线诱导产生的细胞损害及降低胞内高氧化应激状态的作用，这一保护作用可以被沉默HO-1基因表达或其竞争抑制剂（SnPPIX）阻断；同时，可增加线粒体内锰超氧化物歧化酶（SOD2）含量，减少X射线诱导引起的细胞内线粒体凋亡[5]。Ning等[6]探究了EGCG保护人黑素细胞抗H2O2损伤机制，在黑素细胞中发现EGCG能呈浓度依赖性地减少H2O2诱导细胞内过量产生的ROS，发挥抗氧化作用。过量的ROS会导致线粒体功能低下及扰乱正常电子转移，引起更多的ROS产生；也可导致线粒体膜通透性转运孔开放，线粒体膜电位下降，继而发生细胞凋亡。黑素细胞中，H2O2处理可诱导产生线粒体膜电位下降，以及线粒体凋亡信号半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）升高，EGCG可以反转这些变化，保护黑素细胞。进一步实验指出这是通过降低H2O2诱导的p38 MAPK磷酸化发挥作用的，同时指出EGCG全乙酰化衍生物AcEGCG各方面表现均优于EGCG，且具有更好的稳定性和生物利用度，更有利于运用在疾病治疗中。

2.2 黄芩素（Baicalein） Baicalein是来源于中药黄芩根部的黄酮化合物，已证实黄芩素具有抗炎、抗细胞毒、抗肿瘤等作用。高浓度H2O2可诱导细胞内ROS增多，Baicalein通过清除过多产生的ROS，调控促分裂素激酶通路（ERK/JNK/AP-1）诱导基质金属蛋白激酶（MMP）的表达来改善H2O2处理后HaCaT细胞的氧化应激状态。Liu等[7]证实H2O2处理后PIG1细胞ROS产生增加、线粒体功能障碍和氧化应激相关p38 MAPK通路激活，共同作用下引起细胞损伤。Baicalein呈浓度依赖性抑制细胞内ROS生成，且改善线粒体功能障碍及抑制应激相关p38 MAPK通路活化，发挥抗氧化应激作用，保护应激条件下黑素细胞。此外，Baicalein可通过激活Nrf2-ARE信号通路，诱导下游抗氧化酶HO-1、NOQ1表达，抵抗氧化应激对黑素细胞的损伤[8]。

2.3 芹黄素（Apigenin） Apigenin属黄酮化合物，在不同的细胞类型中表现出抗炎、抗氧化、抗癌等多种生物学活性。白癜风患者体内可检测到高水平的多巴胺（Dopamine，DA），这一变化在进展期患者表现更为明显，已有研究表明高水平的DA可促进ROS分子生成诱导黑素细胞凋亡及细胞毒性作用，DA诱导的黑素细胞氧化应激模型已被应用于白癜风的实验研究当中[9]。Lin等[10]实验证实Apigenin通过抑制DA诱导氧化应激相关JNK、p38 MAPK和Akt通路激活有效减少黑素细胞内ROS产生，发挥抗氧化应激作用，保护黑素细胞。且体内实验证实Apigenin是安全有效的抗氧化剂，高Apigenin饮食可以提高受试者体内超氧化物歧化酶（SOD）、红细胞谷胱甘肽还原酶等抗氧化酶类，提高受试者抗氧化应激能力[11]。

2.4 槲皮素（Quercetin） Quercetin属黄酮醇化合物，在动物及人体实验中，Quercetin在皮肤细胞表现出强大的抗氧化活性，具有保护角质形成细胞免于外源性氧化损伤、清除氧自由基、防止内源性抗氧化分子耗损及抑制紫外线照射引起的脂质过氧化等生物学活性。白癜风患者普遍存在黑素细胞内质网肿胀，这一内质网的形态学改变与白癜风患者体内高氧化应激状态有关[12]，Guan等[13]体外细胞实验证实H2O2处理的黑素细胞可以诱导产生黑素细胞内质网肿胀，影响酪氨酸酶自内质网的正常转运，Quercetin可以减轻H2O2引起的内质网改变，同时还可以拮抗H2O2引起的细胞内ROS水平升高。Chaiprasongsuk等[14]研究发现UVA照射可引起B16F10细胞内ROS聚集，引起氧化应激压力；同时Nrf2核转运和Nrf2-ARE转录调节活性降低，Nrf2下游抗氧化基因（GCLC、GST和NQO1）信使RNA和蛋白表达下降，进一步加剧氧化应激压力。Quercetin可抑制细胞内ROS产生，反转UVA介导的Nrf2-ARE信号通路受损，恢复Nrf2下游抗氧化基因和蛋白的表达，保护细胞免于UVA照射引起的氧化应激损伤。在正常人角质形成细胞中，Quercetin除直接清除ROS外，还可促进抗氧化相关基因包括硫氧还蛋白还原酶1及硫氧还蛋白表达，减少活性氧产生[15]。

2.5 山柰酚（Kaempferol） Kaempferol属黄酮醇类化合物，具有一些有益的生物活性，包括抗氧化作用，具有强效抑制ROS产生和清除ROS的能力，还可促进抗氧化蛋白表达，包括金属硫蛋白、CAT和SOD，增强细胞抗氧化应激能力[16]。此外，可降低H2O2诱导的脂质过氧化及提高SOD和过氧化氢酶（CAT）活性[17]。在正常人角质形成细胞中，Kaempferol除直接清除ROS外，还可促进氧化还原反应相关基因包括硫氧还蛋白还原酶1及硫氧还蛋白表达，硫氧还原蛋白可提供电子参与多种生化反应，从而减少活性氧产生，减轻细胞氧化应激压力[15]。

2.6 芦丁（Rutin） Rutin属于黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗炎等生物学活性。UV射线照射下成纤维细胞内产生过多ROS，扰乱细胞内抗氧化系统，产生氧化应激，Rutin可以强有力清除ROS，直接降低细胞内氧化应激水平，除了直接清除ROS外，一方面Rutin可保护维生素C、维生素E、谷胱甘肽（GSH）等非酶类抗氧化物质活性，另一方面还可抑制细胞内黄嘌呤和NADPH氧化酶活性，减少细胞内ROS如超氧阴离子的生产，提高细胞抗氧化应激能力[18]。此外，Rutin还可通过鳌合过渡金属离子如Fe2+、Cu2+，通过Fenton反应阻止羟自由基的生成发挥抗氧化作用[19]。

2.7 非瑟酮（Fisetin） Fisetin属黄酮醇化合物，生物活性包括抗癌、抗氧化、保护神经等多种作用。Seo等[20]证实Fisetin在人HaCaT细胞株中具有抗氧化作用，通过增加Nrf2转运入核促进HO-1基因相关蛋白的表达发挥抗氧化作用。既往研究认为PI3K/Akt通路在细胞氧化应激损伤中也扮演了重要角色，与Nrf2/HO-1通路有密切联系，各种氧化因子通过PI3K/Akt-Nrf2/HO-1通路激活抗氧化基因表达，恢复细胞内氧化应激平衡[21]，Fisetin在HaCaT细胞的抗氧化能力与PI3K/Akt通路有关，PI3K特异性抑制剂可以阻断Fisetin诱导的Akt磷酸化和HO-1表达，抑制Fisetin对氧化应激状态下HaCaT细胞的保护作用。

2.8 阿福豆甙（Afzelin） Afzelin属于黄酮类化合物，具有多种生物学活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌等多种作用。Shin等[22]研究发现Afzelin可以抑制UVB射线诱导的HaCaT细胞内ROS过度产生，缓解细胞内高氧化应激状态，减轻UVB照射对HaCaT细胞的损害，进一步实验指出Afzelin通过抑制UVB诱导的p38 MAPK和JNK通路活化发挥抗氧化作用。Jung等[23]发现Afzelin可以通过失活糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）进而活化Nrf2-ARE信号通路减少H2O2诱导的黑素细胞内ROS产生和脂质过氧化，发挥抗氧化作用。

3 结语

高水平的氧化应激在白癜风的发生和发展中扮演重要角色，针对氧化应激的治疗可作为白癜风临床治疗靶点之一，丰富白癜风治疗方案选择多样性。但目前针对氧化应激治疗药物选择多样性缺乏，抗氧化应激药物研制具有广泛的应用前景。中草药黄酮类提取物在表皮细胞中抗氧化作用研究已经取得了不错进展，但尚缺乏直接建立在白癜风患者表皮细胞上的直接证据，同时需进一步明确各种提取物在人皮肤细胞中系统性作用，为其用于白癜风的临床治疗奠定理论基础。

[1] Akoglu G,Emre S,Metin A,et al.Evaluation of total oxidant and antioxidant status in localized and generalized vitiligo[J].Clin Exp Dermatol,2013,38：701-706.

[2] Jian Z,Li K,Song P,et al.Impaired Activation of the Nrf2-ARE Signaling Pathway Undermines H2O2-Induced Oxidative Stress Response：A Possible Mechanism for Melanocyte Degeneration in Vitiligo[J].J Invest Dermatol,2014,134：2 221-2 230.

[3] Laddha NC,Dwivedi M,Mansuri MS,et al.Vitiligo：interplay between oxidative stress and immune system[J].Exp Dermatol,2013,22：245-250.

[4] Liu-Smith F,Meyskens FL.Molecular mechanisms of flavonoids in melanin synthesis and the potential for the prevention and treatment of melanoma[J].Mol Nutr Food Res,2016,60：1 264-1 274.

[5] Zhu W,Xu J,Ge Y,et al.Epigallocatechin-3-gallate（EGCG）protects skin cells from ionizing radiation via heme oxygenase-1（HO-1）overexpression[J].J Radiat Res,2014,55：1 056-1 065.

[6] Ning W,Wang S,Liu D,et al.Potent effects of peracetylated（-）-epigallocatechin-3-gallate against hydrogen peroxide-induced damage in human epidermal melanocytes via attenuation of oxidative stress and apoptosis[J].Clin Exp Dermatol,2016,41：616-624.

[7] Liu B,Jian Z,Li Q,et al.Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondria-dependent caspase activation and the p38 MAPK pathway[J].Free Radic Biol Med,2012,53：183-193.

[8] 刘邦民,坚哲,易秀莉,等.黄芩素激活Nrf2/ARE通路对H2O2致黑素细胞（PIG1）氧化应激损伤的保护作用[R].2013全国中西医结合皮肤性病学术年会,2013.

[9] Chu CY,Liu YL,Chiu HC,et al.Dopamine-induced apoptosis in human melanocytes involves generation of reactive oxygen species[J].Br J Dermatol,2006,154：1 071-1 079.

[10]Lin M1,Lu SS,Wang AX,et al.Apigenin attenuates dopamine-induced apoptosis in melanocytes via oxidative stress-related p38,c-Jun NH2-terminal kinase and Akt signaling[J].J Dermatol Sci,2011,63：10-16.

[11]Nielsen SE,Young JF,Daneshvar B,et al.Effect of parsley（Petroselinum crispum）intake on urinary apigenin excretion,blood antioxidant enzymes and biomarkers for oxidative stress in human subjects[J].Br J Nutr,1999,81：447-455.

[12]Ding GZ,Zhao WE,Li X,et al.A comparative study of mitochondrial ultrastructure in melanocytes from perilesional vitiligo skin and perilesional halo nevi skin[J].Arch Dermatol Res,2015,307：281-289.

[13]Guan C,Xu W,Hong W,et al.Quercetin attenuates the effects of H2O2on endoplasmic reticulum morphology and tyrosinase export from the endoplasmic reticulum in melanocytes[J].Mol Med Rep,2015,11：4 285-4 290.

[14]Chaiprasongsuk A,Onkoksoong T,Pluemsamran T,et al.Photoprotection by dietary phenolics against melanogenesis induced by UVA through Nrf2-dependent antioxidant responses[J].Redox Biol,2016,8：79-90.

[15]Sugahara M,Nakanishi J,Katsuta Y.Kaempferol enhanced the intracellular thioredoxin system in normal cultured human keratinocytes[J].Biosci Biotechnol Biochem,2010,74：1 701-1 703.

[16]Kameoka S,Leavitt P,Chang C,et al.Expression of antioxidant proteins in human intestinal Caco-2 cells treated with dietary flavonoids[J].Cancer Lett,1999,146：161-167.

[17]Piao MJ,Yoo ES,Koh YS,et al.Antioxidant Effects of the Ethanol Extract from Flower of Camellia japonica via Scavenging of Reactive Oxygen Species and Induction of Antioxidant Enzymes[J].Int J Mol Sci,2011,12：2 618-2 630.

[18]Gegotek A,Bielawska K,Biernacki M,et al.Time-dependent effect of rutin on skin fibroblasts membrane disruption following UV radiation[J].Redox Biol,2017,12：733-744.

[19]Lue BM,Nielsen NS,Jacobsen C,et al.Antioxidant properties of modified rutin esters by DPPH,reducing power,iron chelation and human low density lipoprotein assays[J].Food Chem,2010,123：221-230.

[20]Seo SH,Jeong GS.Fisetin inhibits TNF-alpha-induced inflammatory action and hydrogen peroxide-induced oxidative damage in human keratinocyte HaCaT cells through PI3K/AKT/Nrf-2-mediated heme oxygenase-1 expression[J].Int Immunopharmacol,2015,29：246-253.

[21]Ma Q.Transcriptional responses to oxidative stress：pathological and toxicological implications[J].Pharmacol Ther,2010,125：376-393.

[22]Shin SW,Jung E,Kim S,et al.Antagonizing Effects and Mechanisms of Afzelin against UVB-Induced Cell Damage[J].PLoS One,2013,8：e61 971.

[23]Jung E,Kim JH,Kim MO,et al.Melanocyte-protective effect of afzelin is mediated by the Nrf2-ARE signalling pathway via GSK-3β inactivation[J].Exp Dermatol,2017,26：764-770.