电镜半薄切片技术的几点改进

刘湘花，张俊霞，孙丽敏，卢小康，李瑞琴

半薄切片(1μm)介于电镜超薄切片(70 nm)和光镜石蜡切片(4～8μm)之间,由于电镜样本小,为使电镜能够观察到目标结构,进行超薄切片前必须做半薄切片进行定位。半薄切片的制备方法和电镜的制备方法一样,经固定、脱水、包埋成树脂块,在超薄切片机上用玻璃刀制取,再经染色后,在光学显微镜下观察。在制片的过程中容易出现染色不均匀、脱片、切片皱折重叠,影响观察与目标结构准确定位等问题。本实验室在半薄切片技术方面积累了一些经验,对染液、染色时间、防脱片和捞片工具方面进行了改进,取得了较好的实验效果。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠海马标本,超薄切片机 (EMUC-7),烘片机 (KD-H),光学显微镜 (OLYMPUS CX31),甲苯胺蓝,硼砂。

1.2 方法

1.2.1 常规环氧树脂812包埋

1.2.2 切片

包埋后的组织块于莱卡超薄切片机 (EMUC-7)上切片,切片厚度为1μm,将切片用牙签转移至载玻片上,至烘片机上70℃烤干。

1.2.3 染色

1)常规染色方法。

染液用0.1 mol/L磷酸缓冲液来稀释甲苯胺蓝(浓度1)。

2)改良染色方法。

1.3 统计学处理

随机选取5组切片,每组20张,使用传统方法和改良方法进行半薄切片,以均数±标准差 (X±S)方式记录各组切片的脱片率及皱褶率,应用SSPS19.0统计软件包,采用one-way ANOVA方差分析,p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

经改良的甲苯胺蓝染色后,细胞核、细胞质、细胞膜界线清晰,层次分明。细胞核色深,细胞质色浅 (如图1所示)。对比传统方法,改良方法出现的皱褶率与脱片率均较低 (p＜0.05,如图2所示)。

图1 传统染色方法与改进染色方法对比

3 讨论

3.1 染液的改进

半薄切片的常规染色方法有甲苯胺蓝染色法、HE染色法等,这些染色方法染色前切片均需要进行脱树脂处理[2],以便染料渗入,染色均匀。但是脱树脂操作费时费力,且消耗试剂,若有树脂残留还会出现染色不均匀,同时也会影响到标本的定位观察[3-4]。本实验室改良了甲苯胺蓝染色法[5-6],用硼砂水溶液作为缓冲液代替磷酸缓冲液,磷酸缓冲液呈弱碱性 (pH为7.2～7.4),而硼砂水溶液呈强碱性 (pH为9.3),用硼砂水溶液代替磷酸缓冲液,能大大提高组织细胞的着色力。

3.2 染色时间的把握

一般的染色时间是3～5 min,改良后染色时间为15 min,且染色的同时将切片放至烘片机上70℃加热,一方面可以使染料着色更加稳固,另一方面加热可防止脱片。

3.3 防脱片技巧

为防脱片,通常的操作是在载玻片上涂一层小牛血清、聚赖氨酸或APES胶[7],有的则用明胶-硫酸铬钾作为半薄切片的粘贴剂[8]。而按照本文所述方法不需要涂抹任何试剂,只需将滴加染液后的载玻片放至70℃烘片机上烘烤,时间约15 min,另外流水冲洗切片时,注意不能直接对着组织冲洗便可避免脱片,操作非常简便。

3.4 捞片的改良

一般捞取切片常用的工具是毛笔、眉笔或者金属环[9-12],但切片不易平展地漂浮于水滴表面,且容易导致切片出现重叠或皱折。本文建议捞片时可以用牙签在水面顺时针捻转将切片卷起,然后再逆时针捻转牙签将切片再漂在载玻片的水滴上,方法简便,且捞取的切片不会重叠,没有损伤,也不会出现皱折。

4 结束语

本文所论述改进后的半薄切片技术更适用于透射电子显微镜半薄超薄切片的准确定位,是一种简便易行、效果良好的方法,值得推广。

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