铜离子（Ⅱ）对槲皮素与牛血清白蛋白结合作用的影响*

许树军,邹淑君,管庆霞

（1.黑龙江中医药大学 实验实训中心，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

前 言

血清白蛋白是体内小分子药物运输的重要载体，能够与吸收入血的药物发生特异性结合，结合能力的不同将决定药物的药效、选择性和毒副作用。而内源或外源共存物质存在时往往影响药物小分子与载体蛋白的结合能力，进而影响其游离浓度和药效[1]。金属离子可直接影响药物小分子与蛋白质的结合，不同金属离子对不同药物小分子与蛋白质结合有减弱作用或增强作用[2]。槲皮素（Quercetin），结构式见参考文献[2]，是许多药用植物中的重要药效成分，存在于很多天然植物当中，具有防止血小板凝聚、防治心血管疾病、增强免疫、抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗纤维化、抗炎等功能[4,5]。是应用前景很好的小分子药物。Cu2+是生物系统中一种独特而有效的催化剂，是三十多种酶的活性成分，对人体的新陈代谢起着重要的作用[5]。血液中的Cu2+可能对药物小分子实时产生影响。本实验通过荧光光谱法研究了Cu2+对槲皮素与BSA相互作用的影响。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

PB-20型pH计：德国赛多利斯仪器有限公司；RF-5301PC型荧光光度计：日本岛津公司。

槲皮素：中国药品生物制品检定所；三羟甲基氨基甲烷（Tris 99.8%）：上海博宏生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA 99.8%）：美国Sigma公司。CuCl2·2H2O及其它试剂均为国产分析纯。

1.2 溶液配制

以pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液为溶剂配制1×10-5mol·L-1的 BSA 溶液（内含 0.01mol·L-1NaCl以维持溶液离子强度），置于4℃的冰箱中保存备用；称取槲皮素，加少量甲醇溶解，再用二次蒸馏水定容获得1×10-4mol·L-1的溶液；用二次蒸馏水溶解CuCl2·2H2O，配制成 1×10-3mol·L-1的氯化铜溶液。

1.3 实验方法

（1）在9个10mL容量瓶中均加入1.2中BSA溶液 1mL，再分别加入 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的1.2中槲皮素溶液，用Tris-HCl缓冲液定容，摇匀。BSA浓度均为1.0×10-6mol·L-1，槲皮素的浓度分别是 0、1.0、2.0～8.0（×10-6mol·L-1）。

（2）在9个10mL容量瓶中均加入1.2中BSA溶液 1mL，再分别加入 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的1.2中的CuCl2溶液，用Tris-HCl缓冲液定容，摇匀。BSA浓度均为 1.0×10-6mol·L-1，Cu2+的浓度分别是 0、1.0、2.0～8.0（×10-5mol·L-1）。

（3）另在10个10mL容量瓶中均加入1.2中BSA溶液1mL，2～10号容量瓶分别加入CuCl2溶液1mL，3～10 号容量瓶依次加入 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的1.2中槲皮素溶液，用Tris-HCl缓冲液定容，摇匀。BSA浓度均为 1.0×10-6mol·L-1；Cu2+的浓度均为1.0×10-4mol·L-1，槲皮素的浓度分别是0、1.0、2.0～8.0（×10-6mol·L-1）。

（1）、（2）、（3）三组溶液各操作三次，分别在290K、300K、310K温度下反应20min。以280nm为激发波长，入射狭缝5nm，发射狭缝3nm，扫描290～450nm范围内的荧光。

（4）数据分析及处理均参考文献[2,6]的方法。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭光谱

图1是300K温度，280nm激发波长，不同情况下BSA的荧光猝灭光谱图。图中A是固定BSA浓度，逐渐增加槲皮素浓度获得的BSA的发射光谱；图中B是固定BSA浓度，逐渐增加Cu2+浓度获得的BSA的发射光谱。可见，BSA在343nm处有最大发射峰，槲皮素和Cu2+均能够降低BSA荧光发射峰的强度，即对BSA的荧光产生猝灭作用。且随着槲皮素或Cu2+浓度的增加，荧光猝灭峰出现规律性的降低，表明槲皮素和Cu2+均与BSA之间发生相互作用，但Cu2+对BSA的荧光猝灭能力比槲皮素弱得多。图中C是Cu2+存在下，不同浓度的槲皮素对BSA的荧光猝灭作用。可见，Cu2+存在时，槲皮素仍然随浓度的增大规律性地对BSA的荧光呈现猝灭能力。

图1 不同情况下BSA的荧光光谱图Fig.1 The fluorescence spectra of BSA under different conditions

2.2 猝灭机理及结合常数

BSA的荧光猝灭作用遵循Stern-Volmer方程，参考文献[6,7]根据荧光猝灭光谱数据可以计算出动态猝灭常数Ksv和猝灭速率常数Kq，如表1所示。表中Qct-BSA表示槲皮素与BSA结合，Cu-BSA表示Cu2+与BSA结合，Qct-Cu-BSA表示在Cu2+存在下的槲皮素与BSA结合。由表1可见，槲皮素对BSA的猝灭常数Ksv随着温度的升高而降低，符合静态猝灭规律。并且猝灭速率常数Kq均处于1012～1013数量级，远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞常数 2.0×1010L·mol-1·s-1。因此，认定槲皮素对BSA的猝灭作用是生成复合物而产生的静态猝灭。Cu2+对BSA的动态猝灭常数Ksv随着温度的升高而升高，从这一点看符合动态猝灭规律。但Kq处于1011数量级，大于2×1010，从这一点看符合静态猝灭机理。结合文献[5]推断，Cu2+对BSA的荧光猝灭可能既有动态猝灭也有静态猝灭，但静态猝灭占主导地位。由表1还可见到，在一定浓度的Cu2+存在下，逐步增加槲皮素的浓度，仍能对BSA的荧光产生规律性的猝灭，且Ksv随着温度的升高而降低，Kq均远大于 2.0×1010L·mol-1·s-1，因此，Cu2+存在时，槲皮素对BSA的荧光猝灭仍是生成复合物的静态猝灭。

表1 三种情况下的作用参数Table 1 The action parameters under three kinds of circumstance

[6,7],以双对数方程lg[（F0-F）/F]=lgKa+nlg[Q]计算结合常数KA，KA的计算结果见表1。可见，不同温度下结合常数存在KA（Qct-BSA）＞KA（Qct-Cu2+-BSA）＞KA（Cu2+-BSA）的关系。槲皮素与BSA的结合常数均处在104～106数量级，属于强结合作用。Cu2+与BSA的结合常数只处在几十L·mol-1的范围，说明Cu2+与BSA结合程度较弱。在有Cu2+存在条件下，槲皮素与BSA结合常数大大降低，但仍属于强结合作用。以上结果表明，Cu2+存在时，能够增大槲皮素的非蛋白结合浓度。

2.3 作用力类型

借助Ross理论，结合参考文献[6]，计算出不同情况下槲皮素与BSA作用的热力学数据△G、ΔS及△H，见表2。三种情况下△G均为负值，反应均能自发进行。槲皮素与BSA的作用过程为△H＜0，ΔS＜0，表明槲皮素与BSA之间主要作用力类型是氢键和范德华力。Cu2+与BSA的作用过程为△H＞0，但接近于0，ΔS＞0，表明Cu2+与BSA之间主要作用力类型是疏水作用力，但静电作用力不可忽略[8]。但是，当Cu2+存在时，槲皮素与BSA的作用过程△G、△H、ΔS数值虽有变化，但仍为△H＜0，ΔS＜0，即主要作用力类型仍是氢键和范德华力。表明Cu2+存在，不会影响槲皮素与BSA之间的作用力类型。

表2 不同情况下相互作用的热力学参数Table 2 The thermodynamic parameters of interaction under different conditions

3 结论

结合文献资料和本实验结果可知：Cu2+对BSA具有一定的荧光猝灭作用，且猝灭机理可能既有动态猝灭也有静态猝灭。尽管Cu2+本身对BSA的荧光有一定的猝灭作用，但在槲皮素与BSA的混合体系中，Cu2+的加入不改变槲皮素对BSA的荧光猝灭机理，仍是形成复合物的静态猝灭；不会改变槲皮素与BSA之间的作用力类型。只是使槲皮素与BSA的结合程度减小。这可能归于两方面原因共同作用的结果：一方面是槲皮素B环具有邻位羟基，C环具有相邻的羰基与羟基，具有较强的络合作用，能够与Cu2+形成络合物，使槲皮素与BSA结合的有效位点减少；另一方面可能是由于Cu2+与BSA的结合作用使BSA变成受制状态下的刚性肽链，改变了结合位点处的构象，从而削弱了槲皮素与BSA的结合。实验结果与研究Pb2+,Cu2+,Zn2+,Mg2+,Mn2+对另外几种黄酮与血清蛋白结合的影响的结论相似[9]。该结论可为安全、合理使用药用槲皮素提供理论指导。

参考文献:

［1］ 王公轲．蛋白质和核酸与活性药物小分子相互作用的研究［D］．新乡:河南师范大学,2012．

［2］ 徐暘,许树军,张蕾,等．铝离子存在下槲皮素与牛血清白蛋白的相互作用［J］．哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2016,32（2）:150～153．

［3］ 丁延衸．几种微量元素对人体的作用［J］．生物学通报,1987,（11）:8．

［4］ 吕蔡,张杰．槲皮素的药理作用［J］．国外医药:植物药分册,2005,20（3）:108～112．

［5］ 张志琴,朱双雪．槲皮素的药理活性与临床应用研究进展［J］．药学研究,2013,36（7）:400～403．

［6］ 邹淑君,许树军,董黎明,等．光谱法比较木犀草素及槲皮素与牛血清白蛋白相互作用［J］．光谱实验室,2013,30（6）:2870～2877．

［7］ 邹淑君,张蕾,郭迎喜,等．橙皮素及橙皮苷与牛血清白蛋白作用的比较［J］．中医药信息,2014,31（2）:8～12．

［8］ 梁彦秋．铜（Ⅱ）镉（Ⅱ）、几种小分子同血清白蛋白的相互作用研究［D］．上海,华东师范大学,2007．

［9］ FAN YANG,JIE WANG,CHUNXI LIU,et al．Pb2+,Cu2+,Zn2+,Mg2+and Mn2+Reduce the affinities of flavone,genistein and kaempferol for human serum albumin in vitro［J］．Arch．Biol．Sci．,2011,63（3）:623～634．