贝类产品中脂溶性贝类毒素检测方法的研究进展

□ 崔 晗 刘玥婷 沈葆真 刘梦遥 大连出入境检验检疫局

随着工业生产和社会的飞速发展，全球沿海地区大量的工业废水和生活污水排入海洋，导致水体富营养化，海洋环境日趋恶化，赤潮频繁发生，赤潮藻毒素泛滥，海洋贝类通过滤食在体内富集，再通过食物链传递到食用的人和动物身上，对健康产生危害[1]。由贝类毒素引起的人体中毒事件不断发生，同时赤潮对海洋养殖业也造成破坏性损失。

1 脂溶性贝类毒素简介

贝类毒素（shellfish toxin）又称赤潮生物毒素（red tide toxin），是赤潮生物产生的一系列天然活性毒素。滤食性鱼、虾和贝类通过滤食活动将这些毒素富集在体内，导致海洋生物中毒，这些中毒的鱼、虾和贝类再通过食物链的传递导致食用的人和动物中毒。因为不同的赤潮生物产生不同的贝类毒素，造成贝类毒素化学结构和特性的巨大差异。2004年，由世界卫生组织、联合国粮农组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳软体生物毒素工作组将贝类毒素分为8类，包括大田软海绵酸毒素组（okadaic acid，OA）、虾夷扇贝毒素组（yessotoxin，YTX）、原多甲酸毒素组（azaspiracid，AZA）、蛤毒素组（pecenotoxin，PTX）、短裸甲藻毒素组（brevetoxin，BTX）、环亚胺类毒素组（cyclic imine，CI）、软骨藻酸组（domoic acid，DA）和石房蛤毒素组（saxitoxin，STX）。现有的8大类贝类毒素中DA和STX易溶于水，为水溶性贝类毒素（hydrophilic phycotoxins，HPs）， 而 OA、YTX、AZA、PTX、BTX和CI为聚醚类物质，易溶解于甲醇、乙醚等有机试剂，因此被称作脂溶性贝类毒素（lipophilic phycotoxins，LPs）。LPs具有热稳定性，通过加热等常规加工方式只能降低产品的水分含量，而不能导致LPs的降解，这类贝毒在贝类内脏和肉质等组织中的分布情况也不存在显著性差异。目前，已发现的LPs引起的中毒症状多为腹泻、恶心、呕吐等，中毒症状较普通细菌感染发作时间短，通常为食用后几小时，甚至短至几十分钟，且没有相应的解毒药物治疗，所以这类毒素对消费者带来的潜在危害更难预防，已成为当前贝类毒素研究的重要关注领域。

2 脂溶性贝类毒素检测方法分析

目前，LPs的检测方法主要有小鼠生物法、生物免疫法、细胞毒性法以及近年来迅速发展的化学仪器分析法等，小白鼠生物法在未知贝毒的发现和研究过程中发挥了巨大作用，目前仍是我国法定的分析方法，并在世界范围内被普遍采用，但是该方法由于内在的不确定度超过20%以及动物福利等种种原因，欧盟、加拿大等地区与国家已相继提出了化学仪器分析技术替代小鼠生物法的建议，继而推动了液相色谱质谱联用（LC- MSn）技术在LPs检测领域的快速发展。

2.1 小鼠生物法

小鼠生物法是由Yasumoto 等建立的[2]，为全世界许多国家监测LPs所使用，该法用丙酮从贝类组织中提取出毒素，再经减压浓缩蒸干，用1%的吐温60溶解残留物，腹腔注射小白鼠，观察其存活情况，根据小鼠不同的死亡时间，判断毒性的大小。该方法的优点是技术容易掌握，不需要使用大型分析仪器，但特异性较差，不能提供特定LPs的检出限，在检测过程中，多种LPs如 OA、YTX 、PTX和 AZA等毒素可能被同时检测到，甚至包括毒性未知的其他贝类毒素，对小鼠都具有毒性作用。由于易受到游离脂肪酸等内源性化合物的影响，极易造成假阳性结果，且动物死亡时间的判断受主观因素以及小鼠个体特性的影响，导致该方法准确性不高。此外，小鼠活体毒性试验越来越受到动物保护主义者的反对，目前，很多国家已逐步禁止该方法的使用。

2.2 生物免疫法

和小鼠生物法相比较，免疫分析法具有更好的特异性和灵敏度，该方法主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）[3]和放射免疫法（RIA）。目前，已有酶联免疫吸附检测试剂盒应用于LPs的测定，市售的DSP Check R 和Rougier Bio-Tech R两种试剂盒均能从甲基-OA提取物中准确定量出OA含量，与化学仪器分析法相比，检测更快速，但由于LPs的毒性与甲基-OA、OA或这两种物质的混合物的含量都有关系，导致ELISA法不能够准确地判断贝类产品的总毒性。生物免疫法作为重点发展的贝毒检测技术之一，也应用于生物传感器上，未来几年在现场和快速高效贝类毒素检测方面，用来检测LPs复合物毒素的生物传感器可能会有很好的发展前景。生物免疫法与其他非化学性分析方法相比，在灵敏度、特异性上有了很大的提高，但必须有高质量的酶制剂，且无法提供详细的毒素成分信息等，这也限制了该方法在贝类毒素定性和定量方面的应用。

2.3 细胞毒性法

细胞毒性法是LPs体外细胞测试法中较为常见的一种分析方法，主要是用血清培养鼠白血病细胞，再加入LPs毒素提取物，细胞生长受到抑制，通过测定细胞受抑制的情况来定量LPs。该方法选取的细胞在整个毒性测试过程中极易出现大面积死亡的情况，方法重现性无法满足检测需求，不适于推广应用。

2.4 化学仪器分析法

LPs的化学仪器分析法主要指液相色谱法（LC）和液相色谱质谱联用法（LC-MSn）[4]。LC法通过连接紫外或荧光等不同的检测器来检测不同的LPs毒素成分，但由于大部分LPs在紫外区无吸收或吸收较弱，且不具备自发荧光能力，只有极少数如OA毒素可通过9-蒽基叠氮甲烷衍生后，用荧光检测器进行定量，因此LC法在检测LPs的领域受到局限。目前，随着液相色谱质谱联用（LC-MSn）技术的不断发展，国外已逐步将LC-MSn法用于LPs的分析，并对其特征和含量进行研究，2012年，欧盟提出将液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）作为贝毒测定的参考方法（EN 16204-2012），美国、加拿大及国际食品法典委员会也相继提出用LC-MS/MS法替代小鼠生物法作为贝毒标准检测方法的建议，同时大幅度降低了贝类毒素的限量标准。LCMS/MS法在LPs分析中具有明显的优越性：①灵敏度高；②特异性强；③分析时间短；④能够准确定量不同毒素组分。虽然这种方法研究起步较晚，但发展极为迅速，目前所有LPs毒素组均建立了相应的LC-MS/MS分析方法，而且该方法的定性和未知物筛查能力，对于新型毒素的发现和确证有很广阔的发展前景。

3 建议

我国已于2016年正式发布了GB 5009.212-2016《食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定》，规定了小鼠生物法、酶联免疫吸附法和液相色谱-串联质谱法三种方法均可作为腹泻性贝类毒素大田软海绵酸（OA）、鳍藻毒素-1（DTX-1）和鳍藻毒素-2（DTX-2）的标准检测方法，建议今后以分析方法标准化为基础，系统地开展我国LPs的污染状况及分布规律研究、LPs毒理学和生态毒理学研究、贝类产品中LPs的限量标准和管控措施等，以提高我国贝类毒素研究能力和监管水平。

[1]周名江,李钧,于仁诚,等.赤潮藻毒素研究新进展[J].中国海洋药物 ,1999：48-54.

[2]Yasumoto T, Oshima Y, Yamaguchi M. Occurrence of a New Type of Shellfish Poisoning in the Tohoku District[J].Nihonsuisan-gakkai-shi,1978(11)：1249-1255.

[3]Uzuki T, Yoshizawa R, Kawamura T,et al. Interference of Free Fatty Acids from the Hepatopancreas of Mussels with the Mouse Bioassay for Shellfish Toxins[J].Lipids,1996(6)：641-645.

[4]Jorge R, Araceli E R, Gonzalo L, et al. Automated Online Solid-phase Extraction Coupled to Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry for Determination of Lipophilic Marine Toxins in Shellfish[J].Food Chemistry,2011(2)：533-540.