微小RNA 作为骨质疏松症的诊断工具及治疗靶标的研究进展

王佳瑶 王春庆

随着对微小RNA（miRNA）的深入研究，发现其在骨质疏松中起着举足轻重的作用,已成为各种生理和病理过程的重要转录后调节因子。miRNA调节骨形成和骨吸收，有助于维持骨稳态。异常的miRNA 信号传导可导致骨骼疾病的发生和发展，如骨质疏松症。miRNA 可被分泌到循环中并具有非侵入性生物标志物的临床潜力，基于此种特性，miRNA 有望成为骨质疏松的诊断工具和治疗靶标，也将代表未来的研究方向，现就其研究进展综述如下。

1 miRNA 在骨代谢中的作用

骨代谢是骨吸收和骨形成的协调活动，是骨骼不断拆除和重建的过程[1]。在生长发育期，骨形成超过骨吸收。一旦成人骨量达到峰值BMD（骨密度），通过破骨细胞和成骨细胞的平衡活动保持数十年，形成骨稳态。在衰老期，沉积骨的绝对体积减少，这是由于成骨细胞形成减少并加剧分化；此外，破骨细胞介导的骨吸收，特别是在骨质疏松期间逐步增加，使得骨形成和骨吸收之间的比率不平衡，因为形成的骨数量低于吸收的骨量，导致骨结构的恶化，骨量和骨密度降低，最终导致骨质疏松症及相关的脆性骨折[2]。

骨质疏松症是目前老年人的一种常见且复杂疾病，目前患病人数正在急剧增加，据统计，全世界骨质疏松症的患病人数超过7500 万人，到2020年，这一数字将增加约1 400 万人。骨质疏松相关骨折每年超过150 万，髋部骨折预计在2050年达到630 万，髋部骨折后第一年的死亡率高达20%。骨质疏松发生是多种因素导致的，骨强度的受损，骨微结构的变化使得患病人群骨折风险增高[3]。骨质疏松也常引起椎骨压缩骨折，骨折伴有身高降低，腰背部疼痛，脊柱畸形和死亡的风险大大增加。它可以将人患有椎体骨折的风险增加5～10 倍[4]。

miRNA 是一类进化保守的短非编码RNA，是各种生物过程的关键调节因子。在人类基因组估计编码的miRNA 超过1800 个，预测每个miRNA都可以调控几个靶基因。计算预测表明，超过50%的人类蛋白质编码基因可能受miRNA 调控[5]。miRNA 发挥的调节是可逆的，有研究表明反馈/正向调节环在翻译过程中发挥修饰作用[6]。大量证据表明miRNA 可以调节骨代谢的过程。

2 miRNA 调节骨形成

许多研究已经确定了特定miRNA 骨形成及成骨细胞的分化和功能中的重要作用。成骨细胞的分化是骨稳态的重要过程，有研究指出成骨细胞中miR-34 家族的调节，在小鼠细胞中，miR-34b 和miR-34c 在成骨细胞分化过程中被BMP-2 诱导并上调。miR-34b 和miR-34c 通过直接靶向几种重要的成骨细胞相关因子（如Runx2、Satb2、Notch1和Notch2）影响成骨细胞的分化。这些实验表明miR-34b/c 的过表达降低了成骨细胞功能，导致骨质疏松表型[7，8]。在人类MSCs 中，miR-34a 通过靶向Notch 配体Jagged1 抑制成骨细胞分化，导致异位骨形成的体内模型中骨形成减少[9]。miR-138 鉴定为人类MSCs 分化和骨形成的负调节因子，其在hMSCs 的成骨细胞分化过程中下调，体外研究显示miR-138 的过表达抑制了hMSCs 的成骨细胞分化，而miR-138 抑制物通过对miR-138 功能的抑制，促进成骨细胞特异性基因的表达[10]。通过降低成骨细胞标记物骨钙蛋白（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）的表达水平，miR-221 在成骨分化的C2C12 细胞模型中降低，miR-221 的过表达导致成骨减少。而抑制miR-221 的表达则促进OCN、ALP 和COL1A1活性的增加。此外，RUNX2 被认为是miR-221 的靶标，其反向介导成骨细胞分化[11]。研究者发现miRNA-433-3p 通过靶向dickkopf-1（DKK1）促进成骨细胞分化，dickkopf-1 是典型WNT 信号通路的强有力拮抗剂，并且被认为是骨质疏松症的生物标志物[12]。miRNA-4739 可以靶向调节低密度脂蛋白受体相关蛋白3（LRP3），促进脂肪形成和抑制人类MSCs 的成骨分化。这是第一次确定了LRP3 hsa-miR-4739 轴在平衡中起着促进人类MSCs 的成骨和脂肪细胞分化的生物学作用[13]。过表达miR-375 通过靶向Runx2 抑制成骨分化，碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）和整合素结合唾液蛋白（IBSP）等成骨细胞标志物的活性降低[14]。miR-96 通过抑制成骨细胞中肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）-EGF 受体（EGFR）信号传导促进成骨分化[15]。miR-194 通过调节信号转导和转录激活因子1（STAT1）介导的Runx2 核转位来促进成骨细胞的分化[16]。在间充质干细胞（MSCs）中，miR-124 可通过靶向调节Dlx 转录因子（其中包括Dlx5、Dlx3 和Dlx2 基因）来抑制成骨分化和骨形成[17]。MiR-216a 通过调节c-Cbl 介导的磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）/AKT 途径来增强成骨细胞分化和骨形成[18]。在人MSC 中，miRNA-153 可以通过靶向骨形态发生蛋白受体Ⅱ型（BMPR2）来抑制成骨分化[19]。然而miR-542-3p 则通过靶向调节骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的信号传导来抑制成骨细胞分化和增殖，从而抑制骨形成[20]。

3 miRNA 调节骨吸收

有研究[21]发现miRNA 除了调节骨形成外，还发现了与骨吸收相关的miRNA 的表达模式。miR-503 靶向RANK 使细胞对RANKL 刺激不敏感。拮抗miR-503 增强了骨吸收并减少了体内骨量，并且在卵巢切除的小鼠中加速了这种作用。使用miR-503 的模拟物降低了RANK 丰度和骨吸收，并且保护免受卵巢切除术诱导的骨丢失[21]。与miR-503相反，在PBMC（外周血单个核细胞）的破骨细胞分化期间miR-148a 表达增加，表明其对破骨细胞的调节具有阳性功能。miR-148a 通过抑制V-maf 肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（MAFB），NFATc1和其他破骨细胞促进因子的负调节因子，在体外增强破骨细胞分化和其功能。对miR-148a 施用其抑制物则表现出骨吸收减弱，增加骨形成的现象及增加骨量[22]。miR-34a 在破骨细胞前体中具有最高表达，并且在用RANKL 刺激后表达强烈降低。miR-34a 显示靶向TGFB 诱导的因子同源框2（Tgif2），这是一种同源域蛋白，其在破骨细胞中具有新的正向调控功能。Tgif2 的遗传缺失消除了miR-34a 敲除小鼠的骨吸收增加，表明Tgif2 是破骨细胞中miR-34a 功能所必需的。miR-34a 通过Tgif2 靶向破骨细胞，过表达miR-34a 则显示出骨吸收的抑制。miR-34a 的模拟物高表达减弱了卵巢切除术后小鼠的骨丢失[23]。miRNA-17/20a 在糖皮质激素介导的成骨细胞中起主导作用，其诱导破骨细胞生成。miRNA-17/20a 可靶向RANKL 并抑制成骨细胞中糖皮质激素诱导的破骨细胞分化，miRNA-17/20a 对破骨细胞生成和骨吸收的抑制作用可归因于RANKL 表达的阻断[24]。miRNA-26a在破骨细胞生成的晚期强烈表达。miRNA-26a 模拟异位表达可减弱破骨细胞前体细胞中的破骨细胞和肌动蛋白环形成，结缔组织生长因子/CCN 家族2（CTGF/CCN2）的表达减少，miRNA-26a 抑制剂的过表达促进RANKL 诱导的破骨细胞形成和功能[25]。miR-144-3p 通过靶向RANK 来调节破骨细胞生成，CD14+外周血单核细胞中miR-144-3p 的破坏表达改变了TRAP 活性和破骨细胞特异性基因TRAP，组织蛋白酶K（CTSK）和NFATC[26]。除RANK/RANKL/OPG 信号通路外，miRNA 还可以调节与破骨细胞分化相关的其他信号通路及机制。研究发现miR-126-5p 过表达可抑制破骨细胞分化，减少巨细胞肿瘤基质细胞中的骨溶解形成[27]。

4 miRNA 对代谢性骨病的治疗潜力

基于以上miRNA 在骨代谢中的各种影响发现一些异常的miRNA 表达与骨质疏松症的病理学有关。虽然miRNA 的作用是影响骨代谢，但目前骨质疏松症与miRNA 的关系研究却很少，有研究表明miRNA 的失调可能与某些遗传性疾病有关，如成骨不全等[28]。此外，miRNAs 已被揭示为骨肿瘤的重要病理因素[29]。miRNA 模拟物或miRNA 抑制物的体内递送是以后对于骨代谢类疾病的研究及治疗的重要方向。因此，miRNA 具有诊断和治疗骨代谢紊乱的巨大潜力。目前，与骨质疏松相关的miRNA 仍处于起步阶段。miRNA 作为各种疾病的非入侵性生物标志物已成为目前疾病研究的热门。Hackl 等[30]认为如果人类一旦克服了可靠的临床验证、参考值、方法的实施及成本效益等特定挑战，循环miRNA 就有可能成为骨质疏松症和其他骨病的生物标志物。尽管在动物模型中取得了令人满意的结果，但只有少数miRNA 作为治疗靶标进入临床试验。有研究报道了36例慢性丙型肝炎病毒（HCV）患者miravirsen（一种抑制miR-122 功能的LNA 修饰的反义核苷酸）的安全性和有效性。Miravirsen 治疗导致显著的病毒学应答，最先进的Ⅱ期临床研究已经完成，结果为阳性，并且在临床上没有观察到不良反应[31]。这些结果通过靶向内源miRNA 清楚地显示出治疗效果。

5 miRNA 在骨质疏松症中的作用

Seeliger 等使用miRNA 微阵列鉴定了一组9 个上调但未下调的血清miRNA（miR-93、miR-24、miR-23a、miR-124a、miR-122a、miR-21、miR-125b、miR-100 和miR-148a），并且与30例非骨质疏松症患者相比，这些miRNA 与30例骨质疏松症患者的血清样本中的骨质疏松性髋部骨折相关[32]。而另有研究者鉴定了来自一组760 个miRNA 中的两个miRNA，这两个miRNA 在骨折患者和38例患者的髋关节骨性关节炎非骨折控制之间有显著差异表达[33]。Panach 等也在积极寻找血清样本中miRNA 的异常表达，他们比较了15例骨折患者和12例对照组血清中179 种miRNA 的水平，并鉴定了3 种相对于对照组有效上调的miRNA（miR-122-5p、miR-21-5p 和miR-125b-5p），这成为骨折中合适的生物标志物[34]。同时来自7例女性近期股骨颈骨折患者和7例女性对照的血清样本中的175 种miRNA，其中6 个血清样本中的miRNA 随着骨折的存在而显示出显著的变化（miR-133b、miR-22-3p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、let-7g-5p 和miR-328-3p），然后在11例对照和12例骨折患者中进行测试，这对于之前选择的miRNA 中的三个来说是显著的变化[35]。Kocijan 等分析了36例患者和39例对照的187 个miRNA，分为3 组，绝经前女性、绝经后女性和男性，评估了患有特发性或绝经后骨质疏松性骨折的男性和女性受试者的循环miRNA 特征，一组八个miRNA 在所有三组中都是良好的骨折鉴别标志物[36]。在一项更广泛的研究中，Heilmeier 等从一组375 个miRNA 中鉴定出4 种血清miRNA的组合，每个小组包含17～19例患者，这些miRNA可以区分2 型糖尿病患者和骨质疏松患者的骨折状态的高灵敏度和特异性[37]。在我国Li 等研究了来自120例绝经后妇女的血浆样本中的3 种预选miRNA，分别为正常、骨质疏松和骨质疏松症3组。与正常组相比，骨质疏松和骨质疏松症患者的血浆中这三种miRNA（miR-21、miR-133a 和miR-146）的BMD 的T 水平显著改变[38]。Bedene 等在17例骨质疏松症和57例对照受试者中研究了9 种miRNA，这些miRNA 在之前的基于骨和骨关节炎表达的筛选中显示出前景，并且鉴定了miR-148a-3p与对照组相比在骨质疏松症患者血浆中显著更高。血浆miR126-3p 和miR423-5p 与骨质量的测量相关列出的研究揭示了在骨质疏松症患者中循环miRNA 的重要作用[39]。miRNA 作为最丰富的RNA种类，可以在循环中很容易地被检测到。

6 骨质疏松症的生物标志物

尽管在临床常规中对标准化工具的认识和发展有所提高，但骨质疏松症的诊断和治疗仍没有很好的临床指标。目前，骨折风险评估主要基于通过双能X 射线吸收测定法（DXA）测量的BMD（面积BMD）和评估临床评分，如WHO 骨折风险评估工具（FRAX）。然而，这两种方法都有一定缺陷[40]。此外，用于骨转换的血清标志物，如：前胶原1 型N 前肽（P1NP）成骨细胞活性/骨形成和I 型胶原的C末端端肽（CTX）用于破骨细胞活性/骨吸收尚未在诊断中得到验证，是因为中度骨质疏松与骨折的关联有局限性[41]。因此，这就需要新的生物标志物来识别骨质疏松人群增加的骨折风险。循环中的miRNA 正在成为骨病中生物标志物的强有力的候选者，如近年来研究所强调的，旨在鉴定与BMD 相关的miRNA 特征的研究主要集中在循环外周血单个核细胞（PBMCs）中的miRNAs[32]。对20例绝经后白种人女性的小队列中的365 个miRNA 进行分析，发现BMD 低的女性中miR-133a 的表达显著增高。而从相同受试者分离的循环B 细胞中的miR-133a表达水平与BMD 无关，这表明miR-133a 可能是确定绝经后骨质疏松症的单核细胞特异性标记物。这些发现在另一项研究中得到证实，该研究分析了骨质疏松症患者外周血单个核细胞中721 种miRNA的表达[21]。除了单核细胞外，在120例绝经后妇女的中国队列中，发现miR-133a 在骨质疏松症妇女的血浆中上调[38]。而miR-133a 基因位于以前与全基因组关联研究（GWAS）骨质疏松症相关的两个位点支持miR-133a 与骨质疏松症之间的潜在联系[42]。

在单核细胞中鉴定并随后在血清中发现的另外 的miRNA 是miR-21-5p。尽 管miR-21-5p 的表达在骨质疏松症女性的PBMC 中下调，但其在骨质疏松患者血清中却显著上调[32,38]。此外，比较骨质疏松髋部骨折和非骨质疏松性骨折患者血清和骨组织的miRNA 谱，miR-21-5p 在骨质疏松症患者骨组织中表达较高。对来自10例骨质疏松性骨折患者和10例对照的两个合并样本中的83个miRNA 进行初步筛选，随后在更大样本中进行验证，确定了9 个在骨质疏松患者血清活检中差异表达的miRNA 的较非骨质疏松性骨折的患者上调。其中，5 种miRNAs（miR-21-5p、miR-23a-3p、miR-24-3p、miR-100-5p 和miR-125b-5p）在骨质疏松症患者的骨组织活检组织中表达上调[32]。与骨关节炎患者接受髋关节置换手术相比，西班牙骨质疏松性髋部骨折女性血清中miR-21-5p 和miR-125b-5p 也被上调，此研究支持其作为骨质疏松性骨折的有价值生物标志物的潜力[34]。

虽然到目前为止大多数研究都集中在鉴定绝经后骨质疏松症中的miRNA 谱，但最近的两项研究表明miRNA 是否可以区分不同骨脆性条件下的骨折状态[36，37]。研究中分析了187例患者循环miRNA 的血清水平，分析了男性和女性患者的病理性骨质疏松症和低创伤性骨折以及绝经后骨质疏松症和低创伤性骨折患者。与没有骨折的健康年龄和性别匹配的对照相比，所有3 个亚组都显示出miRNA 表达谱的差异。在所有3 个亚组中共同调节的19 种miRNA 中，8 种（miR-152-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p、miR-324-3p、miR-19b-3p、miR-335-5p、miR-19a-3p 和miR-550-3p）被确定为低创伤性骨折患者的重要鉴别者。而一些miRNA 与骨转换标志物和BMD 相关，如促进成骨细胞分化和骨形成的miR-29b-3p 与P1NP 呈正相关[36]。因此，miRNA 不仅可以用作骨折患者的鉴别者，还可以用作骨转换的标志物。

在一项相关研究[37]中，血清miRNA 特征在80例患有糖尿病性骨病或绝经后骨质疏松症的绝经后妇女的特征队列中进行了研究。两个研究组分为4 组：非糖尿病绝经后妇女、无骨折非脆性绝经后妇女脆性骨折、Ⅱ型糖尿病绝经后妇女无脆性骨折、Ⅱ型糖尿病绝经后妇女脆性骨折。375 个循环miRNA 的表达分析显示，48 种miRNA 可以区分Ⅱ型糖尿病妇女的骨折状态，4 种miRNA 可以区分糖尿病相关的骨折。在非糖尿病队列中，23 个miRNA 在是否骨折的受试者之间存在差异表达。与对照组相比，Ⅱ型糖尿病和非糖尿病患者骨折中3 种miRNA 上调，3 种miRNA 下调。进一步多变量分类分析和建模致使miR-550a-5p 和miR-382-3p 被鉴定为糖尿病患者的最佳鉴别者，miR-382-3p 和miR-183p 被鉴定为绝经后骨质疏松症最有希望的循环miRNA。功能上，在骨折患者中一直下调的miR-382-3p 强烈增强了人脂肪组织来源的间充质基质细胞（MSC）的成骨细胞分化。相反，上调的miR-550-5p 则抑制成骨细胞分化，虽然这些发现需要进一步验证，但研究者认为循环中的miRNA不仅可以作为生物标志物，而且在功能上也很重要，至少可以部分地解释骨质疏松症和其他骨病的病理机制。

综上所述，miRNA 可以作为新的生物标志物用于早期诊断和治疗，它可能是药物开发的潜在目标。然而，为了研究循环miRNA 在骨质疏松症和骨骼中的重要性，全面大样本研究和长期随访十分必要。因此，miRNA 在骨质疏松领域有广阔的研究前景，miRNA 不仅成为成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞相关骨吸收的关键调节，从而有助于骨量维持，而且异常的miRNA 信号传导网络可以影响疾病的发生和发展。此外，miRNA 还可以从细胞分泌以调节骨环境中的通讯。所以，使用miRNA 作为治疗代谢性骨病的诊断工具和治疗靶标为临床研究提供了新思路、新方向。