外周血甲基化SEPT9在恶性肿瘤诊断及监测应用中的研究进展

覃宇周 赖浩 黄名威 吴留成 阳扬 钟华戈

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院胃肠外科

SEPT9广泛分布于真核细胞，其产物属于GTP结合蛋白，生理功能主要是参与维持细胞骨架以及调控囊泡运输、细胞极性、细胞分裂和细胞凋亡等生理过程。甲基化SEPT9在恶性肿瘤发生发展中发挥重要作用。本文就外周血甲基化SEPT9检测在恶性肿瘤诊断、监测应用中的研究进展作一综述。

1 SEPT9基因概述

SEPT9基因是septin基因家族成员之一，位于人类染色体17q25.3，长度约24×103bp，包含17个外显子。SEPT9至少有18种转录产物，编码包括长型（SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3）、中等型（SEPT9_v4、SEPT9_v4*）和短型（SEPT9_v5）等 15 种多肽［1］。除胸腺及脑组织外，其编码的septin蛋白在其他组织中均有分布［2］。通过对SEPT9进行生化结构研究发现，SEPT9的生理功能主要通过中央区域的鸟核苷酸相互作用序列与部分主要细胞骨架成分相互作用，召集其他蛋白至细胞质的特定位点，而在细胞增殖、分裂、运动以及调节微血管、转运等方面起重要作用。在细胞分裂末期，如SEPT9受到小干扰RNA影响，将导致细胞不能完全分裂，最终产生双核或多核细胞［3］。

DNA甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰，调节基因表达和关闭，与恶性肿瘤、衰老、老年痴呆等多种疾病密切相关。DNA甲基化包括高甲基化和低甲基化，通常认为高甲基化可导致基因沉默、蛋白表达降低。DNA甲基化检测因此被应用于肿瘤诊断及预后判断、监测［4-5］。SEPT9甲基化可导致基因表达异常，引起细胞分裂异常和癌变。SEPT9在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等肿瘤均有表达，在不同组织来源肿瘤中的表达存在差异［6-7］，但SEPT9_v2启动子高甲基化是结直肠癌形成过程的特有表现［8］，说明甲基化SEPT9可能是肿瘤形成的启动因子，而DNA甲基化可能是调节SEPT9不同转录本差异表达的机制之一［9］。

2 外周血甲基化DNA及检测方法

外周血游离DNA是在外周血中发现的与任何细胞碎片均无关联的DNA，通常从细胞脱落，包括白细胞、癌细胞。从癌细胞脱落的游离DNA不仅与癌细胞有相同的突变，也存在同样的甲基化改变［10］。研究表明，多数肿瘤患者的循环DNA浓度呈不同程度升高［11］。因此，基于外周血游离DNA中的肿瘤特异性甲基化检测是一种潜在的非侵入性、基于血液分析的肿瘤诊断手段［12］。过去十多年，DNA甲基化检测技术已取得显著进步，有多种不同的检测技术，主要通过三种途径：甲基化特异性限制性内切酶、甲基化DNA的亲和纯化和DNA的亚硫酸酯转化［13］。目前，多数方法依赖于亚硫酸氢盐的DNA转化及延伸的PCR方法，包括MethylationspecificPCR（MSP-PCR）、SMART-MSP、MethyLight、Methylation-sensitive high resolution melting（MS-HRM）、Sanger sequencing of bisulfite treated DNA、Pyrosequencing、Next generation sequencing、Mass-ARRAY EpiTYPER等8种。以上检测技术各有优缺点，如何选择合适的检测技术很大程度上取决于样本数量、所需信息以及成本等［14］。

3 外周血甲基化SEPT9与恶性肿瘤

甲基化SEPT9存在于多种恶性肿瘤组织中，随着甲基化DNA检测方法不断改进和优化，围绕甲基化SEPT9检测也在多种肿瘤中展开研究，尤其是基于外周血的检测研究，但目前大多研究关于结直肠癌，在其他恶性肿瘤中的研究还处于起步阶段。鉴于表观遗传学的发展以及外周血甲基化SEPT9在结直肠癌研究取得的成果，不少学者也开始在其他癌种开展研究。

3.1 结直肠癌

表观遗传学研究表明，DNA异常甲基化是散发结直肠癌发生发展的早期事件。2008年Lofton-Day等［15］证实结肠癌组织SEPT9启动子存在不同程度甲基化。生物标志物在结直肠癌组织与外周血的高度一致性，使液体活检技术在结直肠癌诊断中的研究得以迅速发展［16］。Ladabaum 等［17］比较几种结直肠癌筛查方法，包括外周血甲基化SEPT9检测、粪便隐血试验（fecal occult blood test，FOBT）和粪便免疫化学试验（fecal immunochemical testing，FIT），发现外周血甲基化SEPT9检测的检出率为35%～41%，且更经济、依从性更高。其他研究亦认为其可作为结直肠癌诊断的辅助手段［18-19］。而有研究发现外周血甲基化SEPT9检测较糖蛋白标志物（CEA、CA199、CA242、CA72-4 和CA125）更敏感，以上标志物单独检测的敏感度为18.8%～52.2%，5项指标联合的敏感度、特异度分别为85.3%、95.0%，与单独外周血甲基化SEPT9检测效果相似［20］。因此，Church 等［21］牵头开展了 PRESEPT 研究，纳入7 900余例患者，其中结直肠癌53例，外周血甲基化SEPT9检测的敏感度为48.2%，特异度为91.5%。需要指出的是，该研究收集的标本均来自有症状的患者，可能使总体敏感度下降，甚至低于较早开展的几项研究的敏感度（67.0%～79.3%）和特异度（86%～99%）［19，22-23］。而其他甲基化基因，不管是基于粪便还是血液检测，均没有甲基化SEPT9敏感［16，24］。

甲基化SEPT9联合其他检验方法可提高结直肠癌诊断的敏感度和特异度。He等［25］联合检测ALX4、SEPT9和TMEFF2等基因甲基化的表达，发现血液标本诊断结直肠癌的敏感度和特异度高于组织标本，分别为87%、90%。联合其他基因（包括ALX4、BMP3、NPTX2、RARB、SDC2和 VIM等）检测的研究亦得到相似结论［4］，而联合SEPT9、SHOX2检测可提高结直肠癌在腺瘤、炎症性肠病的检出率［26］。在各期结直肠癌中，Ⅰ期甲基化SEPT9阳性率大约为30%、Ⅱ～Ⅲ期为50%～70%、Ⅳ期为70%～100%，随分期增加，甲基化SEPT9阳性率有升高趋势，但各研究数据差异较大［15，18，21，27-28］。目前 2 项研究［28-29］关注外周血甲基化SEPT9应用于术后监测，给结直肠癌术后疗效评估和复发转移检测提供了新思路。但由于人口统计学特征、病理特征、检测技术等因素导致样本异质性较大，以及筛查成本效益考量、结肠腺瘤和癌前息肉病变检测准确性有待提高等问题［30］，且甲基化SEPT9阳性率受多种因素的影响，比如早期疾病、年龄＞65岁、糖尿病、关节炎和动脉硬化等［31］，是否具有种族差异亦未明确［28］。因此，外周血SEPT9甲基化检测的临床可用性仍有限。

3.2 胃癌

Lee等［28］收集了153例胃癌患者的外周血样本，发现外周血甲基化SEPT9检测的敏感度为17.7%，特异度为90.6%。随访期间，观察到外周血甲基化SEPT9阳性患者有远处转移倾向，无病生存率较低。亚组分析显示，肠型（23.5%）、混合型（40.0%）患者的外周血甲基化SEPT9阳性率较弥漫型（7.3%）更高。而外周血甲基化SEPT9联合CEA、CA19-9诊断胃癌的敏感度提高到32.7%。由此认为，外周血甲基化SEPT9检测可能是胃癌筛查的有效手段。

3.3 头颈磷状细胞癌

研究显示头颈磷状细胞癌组织中25%的RNA表达下降，甲基化SEPT9阳性率为56%，提示甲基化SEPT9可能有肿瘤抑制功能［32］。另一项研究中，头颈磷状细胞癌组织甲基化SEPT9的阳性率为63%，可能与放疗、香烟或酒精暴露相关［33］。Schröck 等［34］研究则显示，外周血甲基化SEPT9诊断头颈部鳞癌的敏感度为59%，特异度为96%，甲基化SEPT9初始水平升高不仅与T分期、N分期、血管和淋巴浸润以及肿瘤分级相关，还与局部复发、远处转移、总生存以及高死亡率相关，而检测外周血甲基化SEPT9可使47%的患者较临床发现复发转移平均提前377 d。提示外周血甲基化SEPT9检测可能是头颈磷状细胞癌有效的分期、风险分层和疾病监测方法，患者初诊如存在甲基化SEPT9高水平，应加强治疗后的监测及随访。

3.4 肝癌

Oussalah等［35］纳入了289例肝硬化患者和98例肝癌患者，检测其外周血甲基化SEPT9情况，发现外周血甲基化SEPT9的肝癌诊断率较高，进一步行多因素分析显示，外周血甲基化SEPT9是诊断肝癌的影响因素，认为其可作为肝硬化患者筛查肝癌有前景的指标，但仍需进一步评估。法国学者一项临床试验（SEPT9-CROSS）正在进行中，该研究拟通过检测440例肝硬化患者的外周血甲基化SEPT9情况，评价其诊断价值，有关方面值得期待。

3.5 其他恶性肿瘤

Powrózek 等［36］检测了 70 例肺癌患者和 100 名健康对照者的外周血甲基化SEPT9情况，发现31例来自ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ期的肺癌患者外周血甲基化SEPT9检测结果呈阳性，而健康对照组只有4名呈阳性。亚组分析显示鳞状细胞癌较腺癌的阳性率更高（60%vs 26%）。但该研究样本量有限，因此外周血甲基化SEPT9检测应用于早期诊断肺癌的可行性仍需扩大样本量进一步验证。Branchi等［37］研究20例胆管细胞癌患者，外周血甲基化SEPT9诊断的敏感度为25%，特异度为99%。进一步检测胆管细胞癌组织的甲基化SEPT9亦得出类似结果，其诊断敏感度、特异度分别为29%、100%。因此认为，甲基化SEPT9作为诊断胆管细胞癌标志物的临床作用有限。而在食管癌组织［38］、非肌肉浸润膀胱癌患者［39］尿液中亦存在甲基化SEPT9，对其检测在诊断及预后监测中有一定价值，但外周血甲基化SEPT9检测在其中的应用价值有待考证。

4 小结

目前的研究已证实外周血甲基化SEPT9检测在结直肠癌筛查和诊断中的作用。相对于传统的FOBT、FIT、结肠镜检等筛查方法，其具有无创伤性、方便、安全、敏感度和特异度较高、依从性较好等特点，有望成为结直肠癌筛查的重要方法。但外周血甲基化SEPT9的检测技术、筛查成本以及检测准确性等尚待进一步改善，未来可考虑结合甲基化DNA在人体生物钟的变化，进一步优化升级外周血检测技术，促进其检测更简易、自动化。今后进一步探索其在恶性肿瘤尤其是结直肠癌、肝癌等疗效评估、复发和转移监测、预后评估等方面的作用和意义值得期待。