PI3K/Akt信号通路在肝脏缺血再灌注损伤中的研究进展

陈 勇， 付 贞， 范 林， 熊 艳， 叶啟发*， 秦 伟

1. 武汉大学中南医院，武汉大学肝胆疾病研究院，武汉大学移植医学中心，移植医学技术湖北省重点实验室，武汉 430071 2. 青海大学附属医院腹部腔镜外科，西宁 810001 3. 中南大学湘雅三医院，卫生部移植医学工程技术研究中心，长沙 410013

肝脏创伤后或肝脏手术如肝脏部分切除、肝脏移植过程中，常需要阻断入肝血流，而血液恢复后，肝脏功能不能立即恢复，大量的炎性因子及氧自由基等会加重肝脏再灌注后损伤，导致患者术后肝功能延迟恢复或者功能衰竭，增加死亡风险[1-2]。多项研究[3-6]表明，PI3K/Akt、p38MAPK、Notch、Wnt/β-certain、等信号通路作用于肝脏缺血再灌注过程并相互影响。其中，PI3K/Ak作为经典的抗凋亡通路，在肝脏缺血再灌注早期即被激活，发挥抗凋亡、抗炎、抗氧化应激和自噬等作用，从而减轻肝脏缺血再灌注损伤[7-13]。本文将就该通路的功能特点与其在肝脏缺血再灌注损伤保护中的作用作一综述。

1 PI3K/Akt信号通路概述

PI3K/Akt信号通路主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB，Akt)组成。PI3K是由催化亚基p110和调节亚基p85组成的异源性二聚体，具有脂类激酶和蛋白激酶的双重活性。在哺乳动物中，主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。生长因子、细胞因子、缺氧、过氧化氢等细胞外刺激PI3K后[14]，使其调节亚基p85解除对催化压基p110的抑制，PI3K二聚体空间构象发生改变，进而被激活，促使底物磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)转变为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)。PIP3作为第二信使与Akt的PH结构域相互作用，导致Akt瞬间易位到细胞膜。Akt在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PKD1)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2(PKD2)作用下，Thr-308和Ser-473位点发生磷酸化，转变为p-Akt。Akt也称为PKB，是相对分子质量为57 000的丝氨酸、苏氨酸激酶，主要分布于细胞胞质中，由3个高度同源但功能不同的亚基组成，即Akt1、Akt2、Akt3。每个亚基都由1个PH结构域、1个丝氨酸/苏氨酸特异性的中间激酶结构域、1个羟基末端疏水结构域组成。不同的亚基在体内的分布也不相同，Akt1主要分布于大脑、心脏和肺部；Akt2主要分布于骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏和胚胎；Akt3主要分布于大脑、心脏和肾脏。Akt作为PI3K的下游靶向分子，当其激活时，可通过磷酸化作用于下游靶蛋白Bad、NF-κB、caspase-9等，维持细胞结构和功能稳定性，减轻细胞损伤程度，因此在肝脏缺血再灌注过程中有显著的保护作用[15]。内源性第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白酶(phosphatase and tensin homolog deleted onchromosome ten, PTEN)、多磷酸肌醇-5-磷酸酶Ⅱ(SH2-containing inositol 5-phosphatase, SHIP2)和外源性抑制剂LY294002或wortmannin均可负向调节PI3K/Akt信号通路，导致第二信使PIP3逆行转化为PIP2，阻断其保护作用。

2 PI3K/Akt在肝脏缺血再灌注损伤中的作用

2.1 PI3K/Akt与炎症因子 研究[12, 16-17]显示，缺血再灌注损伤与炎症因子介导关系密切。Kim等[7]研究PI3K/Akt在一氧化碳预处理肝脏缺血再灌注损伤中的作用时发现，一氧化碳预处理后，肝脏中p-Akt和p-GSK-3β(S9)水平明显增高，促炎因子TNF-α、IL-6、CXCL表达降低，抗炎因子IL-10升高，苏木精 -伊红染色和血肝酶学显示细胞损伤明显减轻。结果说明一氧化碳预处理可诱导肝脏PI3K/Akt通路的激活，并通过磷酸化作用抑制下游因子GSK-3β的活性，进而降低炎性因子的表达，增强抗炎能力，减轻肝细胞损伤程度。

Li等[18]研究PI3K/Akt通路在丹参酮ⅡA预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用时，预处理组腹腔注射10 mg·kg-1·d-1丹参酮ⅡA预处理，1周后行原位肝脏移植，缺血期为30 min。结果显示，各实验组总PI3K、Akt差异无统计学意义，但预处理组p-PI3K、p-Akt较其他组表达增高，提示丹参酮ⅡA增强了PI3K/Akt信号通路激活；与缺血再灌注组相比，预处理组高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)、炎症因子(TNF-α和IL-4)降低和抗炎因子(IL-10和TGF-β)增高；肝功能(ALT、AST、TBIL)、病理和DNA 断裂的原位末端标记法(TUNEL)检查显示，预处理组肝脏损伤较轻。结果提示，丹参酮ⅡA预处理可能启动了PI3K/Akt信号通路，其通过调节炎症相关因子的表达，进而减轻了肝细胞损伤程度。

2.2 PI3K/Akt与氧化应激 正常情况下，体内氧自由基的产生和清除处于动态平衡状态[19]。肝脏缺血再灌注后，过量活性氧(ROS)生成引起氧化应激是导致细胞损伤的关键因素[20-21]。ROS过量生成后，PI3K/Akt信号通路被激活，进而活化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)，NO释放增加[22]。ROS主要包括阴离子(O2-)、过氧化氢分子(H2O2)、羟自由基(OH-)等。Jia等[8-9]研究证实，肝脏缺血与复灌各5 min并连续3个周期的预处理，肝脏保护效果最佳。在此基础上，行大鼠原位肝移植，在复灌时和3 h后分别获取肝脏组织和门静脉血液。肝脏组织免疫印迹检测显示，各组间Akt、eNOS蛋白水平差异无统计学意义。与未预处理组相比，预处理组p-Akt、p-ser1176-eNOS明显升高，氧化应激(ROS、H2O2等)、硝化应激(3-NT)和肝功能指标(ALT、AST)显著降低，同时病理检查提示预处理组肝脏损伤减轻。这可能与缺血预处理上调PI3K/Akt/eNOS/NO表达并抑制氧化应激有关。

2.3 PI3K/Akt与细胞凋亡 PI3K/Akt信号通路通过调节下游多个凋亡相关靶蛋白而促进细胞存活[23-24]。多项研究[25-26]证实，一氧化氮(NO)在缺血再灌注损伤中具有保护作用。Fu等[27]在大鼠自体肝移植缺血再灌注损伤前30 min，经尾静脉注射重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)，分别获取再灌注后各时间点血液及肝脏标本，Western印迹结果显示，各组间Akt和eNOS差异无统计学意义，但rHuEPO预处理组p-Akt、p-eNOS、NO含量增加、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)降低、肝脏细胞凋亡和损伤程度较轻。可见，rHuEPO预处理减轻肝细胞凋亡和损伤程度可能与其激活PI3K/Akt信号通路，增加p-Akt、p-eNOS、NO含量相关。

Zhang等[11]的研究中，大鼠肝脏缺血再灌注损伤前，依次吸入5 min 70%氦气和30%氧气混合气体、空气，3个周期，然后制作小鼠70%肝脏热缺血90 min模型。结果发现，预处理组p-Akt水平在复灌早期即升高；凋亡调节蛋白p-Bad、p-GSK-3β、Bcl-2升高，caspase-3下降。IкBα在复灌1 h后降低，炎性因子CD11b+、CD68+和MPO+下降；血肝酶指标和凋亡细胞计数等提示肝脏损伤程度明显减轻。上述结果提示，氦气预处理能较早启动PI3K/Akt信号通路，并增加细胞抗凋亡能力，减轻炎症反应，缓解大鼠缺血再灌注损伤。

Gui等[28]用齐墩果酸(oleanolic acid，OA)预处理大鼠，Western 印迹检测发现，预处理和未预处理组间AKT、GSK-3β蛋白表达量差异无统计学意义；但在术前及缺血再灌注各时间点，OA预处理组p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β(Ser9)表达较高；血清ALT、IL-1β检测和病理检查证实，OA预处理组肝损伤较轻。结果说明，OA预处理能诱导PI3K/Akt的激活，磷酸化GSK-3β，减轻肝细胞凋亡程度，进而改善肝脏功能。

Sheng等[29]在大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤前用小檗碱预处理，Western印迹检测结果显示，与未预处理组相比，小檗碱组p-Akt(Ser473)表达升高，mTOR表达下降，Bax和caspase-3表达下降，Bcl-2表达升高，Bax/Bcl-2比值降低；小檗碱组凋亡指数降低；小檗碱组肝脏组织Suzuki评分降低；小檗碱组缺血再灌注后各时间点肝组织丙二醛(MDA)降低，超氧化物歧化酶(SOD)升高。结果说明，小檗碱预处理可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而抑制下游凋亡相关蛋白表达，提高细胞抗凋亡能力，同时增强其抗氧化能力，进而减轻肝脏缺血再灌注及氧化应激所致损伤。

Koh[30]建立了褪黑素预处理小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，与未预处理组相比，褪黑素预处理组肝酶指标降低、细胞凋亡程度减轻，p-PKD1、p-Akt、p-Bad和p-Foxo1表达升高，cleaved-PAPR降低。结果说明，褪黑素预处理能激活PI3K/Akt信号通路，进而磷酸化下游相关促凋亡蛋白，抑制其促凋亡活性，进而减轻肝脏缺血再灌注损伤。

2.4 PI3K/Akt与自噬 当缺血缺氧时，ATP合成减少、ROS大量生成、钙超载等不利因素可激活自噬[31-34]。自噬主要通过溶酶体机制及时将衰老及受损的线粒体和过量的氧自由基清除，维持线粒体正常功能，进而缓解肝脏缺血再灌注损伤[35-36]。但氧自由基、钙离子含量超过自噬的清除率时，自噬不能清除全部受损的线粒体，最终导致氧化磷酸化、ATP耗尽，引起细胞不可逆性死亡[37-38]。因此，自噬不足是肝细胞损伤的关键机制[12]。mTOR依赖的自噬信号通路主要是由PI3K来完成[39]。

Yang等[40]的研究中，维生素D预处理组小鼠缺血再灌注损伤肝脏抗氧化能力(MnSOD、过氧化氢酶活性、GSH/GSSG比例)较未预处理组升高，肝细胞损伤评分、ROS及MDA降低，细胞因子TNF-α、IL-6、IL-2及MPO+降低，IL-10升高，自噬相关标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、 Atg-7增加，PTEN表达降低，p-AKT表达升高。由此说明，维生素D预处理能解除PTEN对Akt通路的抑制作用，并增强抗氧化应激能力，诱导自噬的发生，减轻肝脏损伤程度。

Zhong等[41]研究了维甲酸受体α(ATRA)预处理后，PI3K/Akt信号通路在肝脏缺血再灌注中的作用，分别于缺血再灌注后6、20 h获取血液和肝脏组织标本。结果发现，与未预处理组相比，ATRA预处理组血清肝酶及肝脏组织Suzuki评分下降，Bcl-2表达上调，cleaved-caspase 3表达下调，炎症因子FNF-α、IL-1β和IL-6含降低，Foxo3a、p-Akt水平升高，下游Foxo1明显降低，自噬标志蛋白Beclin-1，LC3Ⅰ/Ⅱ增加，与自噬活性成反比的p62降低。结果说明，ATRA预处理可以激活Foxo3a/p-Akt/Foxo1通路，增强肝细胞自噬、抗凋亡、抗炎等能力，减轻肝脏缺血再灌注损伤。

3 总结与展望

肝脏在创伤、占位性病变切除和肝脏移植手术过程中，存在不同程度的缺血，当血液重新恢复供应后，大量的炎性因子、氧自由基蓄积等引起缺血再灌注损伤，导致术后肝脏功能延迟恢复甚至衰竭，严重威胁患者的生命安全。大量动物实验证实，缺血再灌注期间，由于缺氧、细胞因子等刺激可以激活PI3K/Akt信号通路，并发挥积极的保护作用。该通路被激活后可以通过下游相关靶向通路及蛋白发挥抗炎、抗氧化应激、抗凋亡及增强自噬等作用，进而减轻肝脏缺血再灌注损伤。因此，调节PI3K/Akt信号通路有望成为临床预防和减轻肝脏缺血再灌注损伤的有效靶向通路。

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