钙离子非依赖电压依赖分泌模型(CiVDS)的分子机制

经典的囊泡分泌模型是由动作电位激活细胞膜上的电压门控钙离子通道，介导钙离子内流从而引发钙离子依赖的分泌(CDS)。在大鼠初级感觉神经元(DRG)，研究者发现了一种特殊的囊泡分泌模型—钙离子非依赖电压依赖分泌模型(CiVDS)，其分子机制为：电压门控N型钙离子通道(Cav2.2)与囊泡分泌所必须的SNARE蛋白偶联在一起，当发生动作电位时Cav2.2发生构象变化通过SNARE蛋白介导囊泡与质膜融合，从而释放ATP。实验结果（一）：CiVDS的分子结构单元包含3个组成部分：电压感受器(Cav2.2)，囊泡融合必需的SNARE蛋白复合体，以及前两者之间的连接器（synprint区域，位于Cav2.2第二个domain和第三个domain之间的胞内连接区域）。证据如下：（1）使用细胞膜电容(Cm)记录等方法，发现特异性Cav2.2阻断剂芋螺毒素(ω-conotoxin GVIA)能有效抑制CiVDS；（2）CiVDS在3天培养的DRG神经元中会显著降低，降低的CiVDS能被Cav2.2过表达所恢复；（3）在体水平敲低Cav2.2表达水平能显著阻断CiVDS；（4）Cav2.2电压感受区域对于CiVDS很关键，而Cav2.2离子通透区域对于CiVDS作用有限；（5）使用电镜(EM)和TIRF成像方法，我们观察到在CiVDS的刺激条件下DRG神经元中小而清亮的囊泡发生了量子化释放；（6）3天培养的DRG神经元中CiVDS的显著降低能被SNAP-25的过表达恢复；（7）破伤风毒素和肉毒杆菌毒素破坏SNARE蛋白复合体能显著阻断CiVDS；（8）在DRG神经元中，Cav2.2的synprint区域介导Cav2.2和SNAP-25的直接相互作用；（9）全细胞灌注synprint多肽阻断Cav2.2与SNARE蛋白的相互作用，并能有效抑制CiVDS ；（10）synprint截断的Cav2.2失去了恢复CiVDS的能力。实验结果（二）：ATP是CiVDS的囊泡分泌物，证据如下：（1）在CiVDS刺激条件下，通过荧光素酶法能检测到大量ATP的释放；（2）EM成像显示在CiVDS刺激条件下质膜上停靠的囊泡数量减少；（3）TIRF实时荧光成像显示Spy/NPY-pHluorin标记的囊泡在CiVDS过程中发生了胞吐。与CDS相比，CiVDS在DRG神经元静息条件下（动作电位发放＜ 4 Hz）占主导地位，提示CiVDS介导的ATP释放可能在维持本体感觉过程中发挥重要的作用。

（Chai,et al.Neuron, 2017, 96: 1317-1326.陈晓曦 译 柴祖映 刘风雨 校）