土鳖虫发酵前后水溶性蛋白成分含量变化及抗肝癌活性比较

王立娜 张盼盼 王 颖 桑 晓 王岩岩 王集会

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学研究生院，山东 济南 250355；3.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355 )

土鳖又名土元、地鳖，具有活血化瘀的功效。现代药学研究表明, 土鳖及其提取物具有显著的抗血栓、抗凝血、抑制血小板聚集与抗肿瘤功效[1，2]。球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)，一种虫生真菌，属于半知菌类，在生长的过程中可产生多种次生代谢物质，蛋白质、白僵菌素、黄酮，具有一定的抗肿瘤活性，其孢子接触昆虫后，生长菌丝会在适宜的生长条件下萌发，从而侵入虫体发酵。生物转化技术在中药研究中的最新运用——虫类中药的发酵，就是利用微生物在生长的过程中产生的酶系等对虫类中药中所含有的蛋白、白僵菌素、黄酮等成分进行转化修饰，从而生成药效活性更强的物质[3]。本实验把球孢白僵菌作为发酵真菌，将其接种在土鳖虫粉上，应用新型固体双向发酵模式对土鳖虫粉进行深层加工，将二者发生相互作用后，转化修饰的活性成分蛋白质进行研究。将发酵前后土鳖虫通过超声提取，比较蛋白质的含量差异，以及采用MTT法比较发酵前后抗肝癌活性的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药材

土鳖虫粉和发酵土鳖虫粉(山东中医药大学实验室自制，批号20150505)；阳性药(注射用顺铂100 μg·mL-1，齐鲁制药有限公司)

1.1.2仪器

UV9100B 型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；FA1004N 型电子分析天(上海精密仪器有限公司)；HH-6 数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；KQ-500E 型声波清洗器(昆山市 超声仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50FBS，上海申安医疗器械厂)；双人单面净化工作台(AIR TECH，苏净集团安泰公司)；Memmert二氧化碳培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)；台式离心机(SIGMA 1-B 型)；酶标仪(Multiskan MK3,Thermo Scientific)；Nikon 倒置显微镜(TS100，Japan)；超低温冰箱(DW-HL668，中科美菱低温科技有限责任公司)。

1.1.3试剂

牛血清蛋白、福林酚(国药集团化学试剂有限公司)；碳酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾、无水硫酸铜皆为分析纯；1640 细胞培养基与胎牛血清(Hyclone,赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；PBS(磷酸盐缓冲液)；青霉素链霉素混合液双抗；胰酶细胞消化液(碧云天生物技术有限公司)。

1.1.4实验细胞

肝癌细胞株(7402),由山东省立医院提供。

1.2 方法

1.2.1改良Lowry 法测定蛋白质含量[4，5]

1.2.1.1 制备标准牛血清蛋白溶液曲线

精密称取0.020 0 g 牛血清蛋白至烧杯中，用适量蒸馏水溶解，移至于规格为100 mL 的容量瓶中，定容，摇匀，即得0.2 mg·mL-1的标准蛋白溶液。精密量取标准蛋白质溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分别置于试管中，补充水至1.0 mL，然后加入5 mL碱性铜溶液，摇匀，在室温下放置10 min，迅速加入0.5 mL福林酚试剂,摇匀，室温净置30 min，显色后，在紫外分光光度计上于波长650 nm 处测定各样品的吸光度，作出吸光度对蛋白质含量的关系图，得到直线回归方程Y=2.363 9X+0.009 5,r=0.999 3。

1.2.1.2 供试品溶液的测定

精密称取未发酵和发酵土鳖虫粉各0.5000 g 至烧杯中，分别向2 个烧杯中加入15 mL蒸馏水，超声提取10 min，抽滤，倾出滤液，重复上述步骤2次，将3次所得抽滤液混合转移至50 mL容量瓶中，定容，摇匀。分别精密量取2.0 mL发酵前后的土鳖虫水提液于10 mL 容量瓶中，定容，摇匀，精密量取此稀释液1 mL于试管中，加5 mL碱性铜溶液，摇匀，按照1.2.1.1项下方法，测定吸光度，平行测定3 次，求平均值，通过标准曲线计算出土鳖虫水提液中蛋白质的含量结果详见表1。

1.2.2MTT 分析法测定抗肿瘤活性

1.2.2.1 细胞培养

从液氮中取出冻存的肝癌细胞，迅速投入预先加热到37 ℃灭菌水中搅拌，待冻存液溶化后，用含10%胎牛血清、1%双抗的1640 培养基3 mL在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2.2 接种

等细胞生长至80%融合时，用PBS 冲洗3 遍，然后用600 μL 0.25%的胰酶细胞消化液(含0.02%EDTA)消化1 min 左右，吸去消化液，加上3 mL 培养基，吸取2 mL 含细胞的培养基至加样槽并加上4 mL 不含细胞培养基，用排枪吹打上百下，使细胞分布均匀，以每孔100 μL 接种于96 孔板中，空出外围。

1.2.2.3 配药

用电子分析天平分别称取0.010 0 mg 发酵前后的土鳖虫粉至10 mLEP 管中，用移液枪移取5 mL 不含血清的1640 培养液至EP 管中溶解药物，然后用滤头和注射器将药物滤至另一EP 管中，用移液枪分别移取70、140、210、280、350μL 药物至1.5 mL灭菌EP管中，加1640 培养基至700 μL，使药物浓度分别为200、400、600、800、1000 μg·mL-1。

1.2.2.4 加药

细胞培养24 h，待96 孔板中的细胞长满单层后，弃去培养基，空白对照组加100 μL不含血清的1640培养基，对照组加100 μL阳性药，其他给药组每孔分别加入含不同浓度药物的1640培养基100 μL，每个浓度的药物加5 孔。然后细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。

1.2.2.5 MTT 法测定细胞存活率

加药24 h 后，避光条件下在每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL 于培养箱内反应4 h。4 h后，吸出每孔的药物和MTT，然后每孔加入100 μL DMSO，在空白孔加3个DMSO作为调零组，10 min内用酶标仪于492 nm测定A 值，计算细胞抑制率。计算公式：细胞抑制率(%)=[1-(加药组A492-调零组A492)/(空白对照组A492-调零组A492)]×100%。结果详见表2。

2 结果与分析

2.1 土鳖虫水提液中蛋白质的含量

表1 土鳖虫发酵前后可溶性蛋白的含量对比Table 1 The content of soluble protein before and after fermentation of Eupolyphagasinesis Walker

*P<0.01

2.2 土鳖虫发酵前后抗肝癌活性

从表2可以看出，发酵后的土鳖虫对肝癌细胞有一定的抑制作用，且多为高浓度的抑制率较高，并且剂量与抑制率呈正相关。而发酵前的土鳖虫对肝癌细胞的抑制率很小，甚至是没有抑制作用。发酵前后的土鳖虫对肝癌细胞的抑制作用具有明显的差异，与空白对照组相比其差异亦显著。

表2 土鳖虫发酵前后的吸光度及对肝癌的抑制率( X±s)Table 2 The absorbance of Eupolyphagasinesis Walker before and after fermentation and inhibition rate of hepatoearcinoma (X±s)

3 讨 论

本研究中发酵后的土鳖虫中，其蛋白质的浓度与肝癌细胞的存活率存在负相关关系，高浓度组对肝癌细胞的抑制率比低浓度高。而且土鳖虫发酵后蛋白质含量大于发酵前，表明经发酵处理可达到改变有效成分的含量、增大应用范围、增强药效特异性、提高药效的作用。

本实验采用MTT法对不同浓度发酵前后的土鳖虫，其作用下的肝癌细胞的24 h 生长情况进行了观察，结果表明土鳖虫发酵前后对肝癌细胞的抑制作用具有明显的差异，发酵后的抑制作用显著高于发酵前。并且浓度越高抑制率越高。但土鳖虫中除含有蛋白质之外，还含有其他的有效成分，如多糖，核酸等，也可能对肝癌细胞有抑制作用，具体的作用机制还不清楚，因此，这些问题有待于进一步的研究。

[1] 葛钢锋，余陈欢，吴巧凤.土鳖虫醇提物对体外肿瘤细胞增殖的抑制作用及其机制研究[J]. 中华中医药杂志,2013,28(03):826～828.

[2] 王立娜,马明珠,王颖,王集会. 中药土鳖虫发酵前后活性成分的含量对比[J]. 湖南中医杂志,2016,32(08):200～202.

[3] Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A l,, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. J Biol Chem,1951,193:265～269.

[4] 董纯定. 生化药物分析 [M]. 南京 ：中国药科大学出版社 ,1995:142～150.

[5] 张盼盼,张秀云,王集会,等. 发酵全蝎粉杀酶前后各活性部位蛋白含量及抗癌活性研究[J].福建中医药,2014,04:50～51.