大白菜基因组DNA快速提取方法的研究

王 涛，王超楠，张 红，温娟娟，张 斌

(1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津科润蔬菜研究所，蔬菜种质创新国家重点实验室，天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室，天津 300381)

植物基因组DNA的提取是重要的基础性技术，也是影响后续试验结果的关键步骤[1]。目前，常用的大白菜基因组DNA提取方法主要是CTAB法和SDS法[2]，CTAB法中的CTAB能将破碎植物叶片细胞中的DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。SDS法中的SDS在高温条件下能裂解植物细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出DNA。这2种方法提取的DNA浓度高，且基因组DNA的完整性好，在植物分子育种研究上具有广泛的应用，但是其缺点也是很明显的，过程复杂，整个提取过程约3 h，效率低，无法满足快速检测的需要，而且所用到的有些试剂存在毒性，对人的身体健康会造成一定的危害[3]。随着分子标记技术在大白菜育种工作中的应用，经常需要对成千上万的大群体进行DNA提取，如果应用CTAB法或SDS法，则耗时长且工作量巨大。而分子标记辅助选择、纯度鉴定等工作中所需的DNA量不大[4]，提取的DNA也不需要长时间保存。因此，寻找一种简单、快速的DNA提取方法非常必要。

碱裂解法是一种快速提取植物基因组DNA的新方法，在碱性环境中，样品的细胞膜和核膜被破坏[5]，染色体DNA变性分开[5]，然后加入Tris-HCl在DNA提取液中起到缓冲液的作用，使DNA去质子化，提高其溶解性[6]。这种方法提取的DNA量少、DNA保存时间短，但是操作过程简单，耗时短，能满足基本的试验需要[7]。目前文献报道的应用此种方法提取基因组DNA的有高粱[8]、水稻[9]、大豆[10]、玉米[11]、番茄[12]等，而碱裂解法在十字花科植物，如对大白菜基因组DNA提取中还未见相关的报道。本研究对碱裂解法进行了改进，并通过对几种大白菜基因组DNA提取方法的比较，在保证试验结果的可靠性和提高试验效率的基础上，旨在找到一种能够快速提取大白菜基因组DNA的方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为抗根肿病的大白菜亲本G57和感根肿病的大白菜亲本G70，G70和G57杂交获得F1，F1与感病亲本G70回交构建BC1群体，所有试验材料均由天津科润蔬菜研究所提供。

2016年3月将试验的种子播种到育苗盘中，正常管理，育苗培养30 d后，待幼苗长到5～6片真叶时取样，采集叶片2～3片保存于-80 ℃，用于DNA提取。

1.2 试验方法

1.2.1 CTAB法[13]①取大白菜真叶0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)叶片加入1.5 mL离心管中，加50 μL 2%的CTAB提取缓冲液，研磨，补至400 μL，65 ℃水浴40 min，每10 min拿出轻摇一次；②加入400 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇5 min；③12 000 r/min离心5 min；④取上清200 μL至新的1.5 mL离心管，加入预冷的异丙醇200 μL，混匀，-20 ℃放置20 min，取出离心管，12 000 r/min，离心10 min；⑤弃上清，加入150 μL预冷乙醇，上下颠倒，洗净异丙醇，12 000 r/min，离心 5 min；⑥弃上清，室温下晾干2 h；⑦加蒸馏水100 μL溶解DNA，备用。

1.2.2 二步CTAB法[14]①取大白菜真叶0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)叶片加入1.5 mL离心管中，加50 μL 2%的CTAB提取缓冲液，研磨，补至400 μL，65 ℃水浴40 min，每10 min拿出轻摇一次；②加入400 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇5 min；③12 000 r/min，离心5 min；④取上清200 μL至新的离心管，备用。

1.2.3 碱裂解法Ⅰ ①取大白菜真叶0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)叶片加入1.5 mL离心管中；②加100 μL 0.4 mol/L NaOH，研磨；③沸水浴1 min后，10 000 r/min，离心1 min；④取上清液10 μL至新的1.5 mL离心管，再加300 μL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH值 8.0)，混匀备用。

1.2.4 碱裂解法Ⅱ 共4步，其中步骤③，离心管10 000 r/min，离心1 min，其他3步同碱裂解法Ⅰ。

1.2.5 碱裂解法Ⅲ 共4步，其中步骤③中，不进行沸水浴和离心过程，其他3步同碱裂解法Ⅰ。

1.2.6 碱裂解法Ⅳ ①取大白菜真叶0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)叶片加入1.5 mL离心管中；②加入200 μL 0.4 mol/L NaOH，研磨；③沸水浴1 min，直接作为PCR的模板，备用。以上每种方法重复3次。

1.3 提取的基因组DNA质量的检测

1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量(电泳缓冲液为1×TAE)，GelRed染色，在凝胶成像仪上成像、观察。

1.4 PCR反应

取不同方法获得的DNA样本2 μL进行PCR扩增。

1.4.1 引物 分别为Bra019317、Bra019348、Bra019235-2和Bra019345-2。SSR标记为本项目开发的与本抗源抗根肿病基因连锁的分子标记，引物由华大基因公司合成。

1.4.2 PCR反应体系 20 μL，包括模板DNA 2 μL，Forward primer(10 μmol/L)1 μL，Reverse primer(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L each)2 μL，10×Buffer 2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL，ddH2O补足20 μL。

1.4.3 PCR 反应程序 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。

1.5 PCR产物检测分析

2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量(电泳缓冲液为1×TAE)，GelRed染色，在凝胶成像仪上成像、观察。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带多态性。

1.6 不同提取方法DNA保存时间和保存条件的比较

将提取到的DNA分别保存于4 ℃和-20 ℃下，并分别于第1，10，30，45，60天对基因组DNA进行PCR扩增，利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带的清晰度，判断每种方法提取到DNA的保存时间和最佳的保存条件。

1.7 碱裂解法在抗根肿病基因分子标记辅助选择中的应用

选择最优的碱裂解法快速提取G57、G70、F1及BC1群体的DNA，用与抗根肿病基因连锁的标记Bra019345-2，对含抗病基因的单株进行筛选，以检验该方法在分子标记辅助选择中的应用效果。

2 结果与分析

2.1 提取基因组DNA质量的检测

将CTAB法、二步CTAB法和4种碱裂解法提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳。由图1可知，只有CTAB法提取的DNA显示出特异性的电泳条带，其他5种方法未见到特异性的电泳条带，说明CTAB法提取基因组DNA的浓度高、质量好，其他方法提取的DNA可能浓度偏低。

M.DNA MarkerⅠ；①～⑥.提取DNA的CTAB法、二步CTAB法、碱裂解法Ⅰ、碱裂解法Ⅱ、碱裂解法Ⅲ、碱裂解法Ⅳ。图2-4同。M.DNA MarkerⅠ；①-⑥.DNA from CTAB method，two-step CTAB method，alkaline lysis methodⅠ，alkaline lysis methodⅡ，alkaline lysis method Ⅲ，alkaline lysis method Ⅳ.The same as Fig.2-4.

2.2 不同方法提取的DNA为模板的PCR扩增效果的比较分析

分别以这6种方法提取的基因组DNA为模板，使用引物Bra019317和Bra019348进行PCR扩增，2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

结果表明，二步CTAB法和碱裂解法Ⅳ提取的DNA为模板扩增不出特异性条带，而CTAB法和碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以扩增出特异性条带，且条带清晰、明亮。说明CTAB法和碱裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取的基因组DNA能够满足PCR反应的需要(图2)。

A.引物Bra019317;B.引物Bra019348。A.The primer Bra019317;B.The primer Bra019348.

为了进一步验证几种方法的准确性，利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。由图3可知，8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和琼脂糖凝胶电泳检测结果一致，CTAB法和碱裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都可以看到清晰的条带，完全能够满足PCR扩增的需要(图3)。

图3 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果Fig.3 The test results of 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

2.3 DNA保存时间和保存条件的比较

为了判断几种方法提取DNA的保存时间，以及保存温度对DNA保存时间的影响，第1 天时，把试验中6种方法提取到的DNA先用引物Bra019235-2进行PCR，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。再把6种方法提取到的DNA分别置于4 ℃和-20 ℃的条件下保存，分别于第10，30，45，60天对DNA用引物进行PCR，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，观察记录条带情况。结果如图4所示。

对试验结果进行分析可知，碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA在30 d检测时，4 ℃和-20 ℃条件下保存的效果都比较好，30～45 d碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA在4 ℃条件下开始有明显的降解，-20 ℃条件下的保存效果比4 ℃较好，但是DNA也略有降解，第60天检测时，2种保存条件下，碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA进行PCR，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，已经检测不到条带。对CTAB法、碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取DNA的保存时间进行比较，CTAB法提取的DNA保存时间最长，碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取的DNA在30 d内PCR扩增的产物，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到清晰的特异性条带，并可满足进一步试验的需要。

2.4 碱裂解法在抗根肿病基因分子标记辅助选择中的应用

通过试验发现，碱裂解法Ⅲ不仅效率高，提取的DNA也能满足试验的需要。结合碱裂解法Ⅲ进行F1群体和BC1群体的基因型鉴定，鉴定F1群体的杂交率及分子标记辅助选择BC1群体中含抗病基因的单株。碱裂解法Ⅲ提取抗、感大白菜亲本、74株F1群体和74株BC1群体植株的基因组DNA，用与抗根肿病基因连锁的标记Bra019345-2进行PCR，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所有的F1群体和BC1群体植株都检测到了清晰的条带(图5，6)。74株F1群体植株均表现为杂合条带；74株BC1群体植株中有33株表现为感病条带，41株表现为杂合抗病条带。说明碱裂解法Ⅲ完全能够满足大群体纯度鉴定及分子标记辅助选择中对基因组DNA质量的要求。

图6 BC1群体的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果(1～74)Fig.6 The test results of BC1 population of 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis(1-74)

3 结论与讨论

本试验发现，以CTAB法和碱裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ制备的基因组DNA作为模板的PCR扩增产物，都可以被检测到清晰的条带，而二步CTAB法和碱裂解法Ⅳ制备的基因组DNA作为模板的PCR扩增产物检测不到条带。CTAB法的提取时间较长，提取成本也较高[15]。相比较而言，能检测到条带的3种碱裂解法耗时短，操作简单，方便快速，实用性强，结合组织研磨仪可以高通量操作[16]，而且成本低，只用到NaOH和Tris-HCl 2种常规试剂，试验方法大大的简化。尤其是碱裂解法Ⅲ，不需要沸水浴和离心，操作更为简便，效率最高，检测结果也好[17]，是值得推荐的方法。

相比较碱裂解法Ⅳ，加了Tris-HCl的碱裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ制备的DNA作为模板，PCR扩增产物可以检测到清晰的条带，说明使用碱裂解法提取大白菜基因组DNA时，Tris-HCl是必需的[18]。二步CTAB法成本低，耗时短，有文献报道这种方法提取的玉米基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测，DNA的完整性较好[14]，但是在本试验中提取的大白菜基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测，没有检测到特异性条带，这可能和试验材料的不同有关。碱裂解法Ⅲ提取的基因组DNA在保存至30 d时，将基因组DNA作为模板的PCR扩增产物还能通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到清晰的条带，说明这种方法保存时间较长，可以应用于大规模样本的分子标记筛选。

分子标记辅助选择育种，试验的对象都是一个大的群体[19-21]。传统的CTAB法提取基因组DNA的步骤繁琐，本试验寻找到的碱裂解法Ⅲ操作过程简单，耗时短，且保存时间较长，可以满足大白菜大批量快速检测的需要。

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