山羊KLF9基因克隆及在组织细胞中的表达

赵 越，林亚秋，朱江江，林 森，池永东，刘鲁蜀，王 永

(1.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041)

随着我国人民生活水平不断提高，营养更加丰富的羊肉渐渐代替猪肉走进了寻常百姓家，摆上了老百姓的餐桌[1]，这使人们对于羊肉的品质提出了更高的要求。肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)是脂肪沉积的形式之一，与肉嫩度、口感、剪切力等肉品质特性有着极强的正相关[2-4]，是显著影响肉品质与食用口感的重要因素之一。因此，从影响IMF沉积的候选基因入手来阐明山羊肉质性状形成的分子机制具有重要的理论和实际意义。

Kruppel样转录因子家族(KLFs)是一类具有锌指结构的转录因子，对机体的生长发育、代谢平衡都有重要的作用[5-6]。哺乳动物中已发现18种KLF样转录因子(KLF1～18)，该家族一般具有3个锌指结构，与DNA的CACCC元件和富含GC区连接，从而调控转录激活或抑制[7-8]。近些年的研究显示，KLF 家族的多个成员(包括KLF9)参与脂肪细胞分化过程的调控[9-15]。但是，这些研究大部分是以3T3-L1前脂肪细胞系为研究对象获得的，且有研究表明KLF成员在小鼠和猪脂肪细胞分化中的调控作用具有物种特异性[16]。KLF9是KLF家族成员中重要的成员之一，最初从大鼠肝脏cDNA文库中分离[17]，其特点是在高等哺乳动物与人类组织中广泛表达且高度保守。目前对KLF9的研究多见于肿瘤的发生与发展[18-23]，免疫反应和细胞增殖生长等方面[24-26]。有研究显示KLF9可促进3T3-L1前体脂肪细胞分化[13]，但基于其他学者发现的KLF家族成员在脂肪细胞分化中的调控作用存在物种特异性，所以在细胞系中的研究成果不一定适合山羊这个物种。

因此，为了阐明KLF9基因在山羊脂肪沉积中的作用，本试验采用我国第2个国家级肉用山羊新品种—简州大耳羊为对象，并以青藏高原特有的藏山羊作为对比，用RT-PCR技术克隆得到山羊KLF9基因序列，分析其差异，用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)检测其在简州大耳羊和藏山羊各个组织中的表达特性及差异，同时检测了KLF9基因在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同阶段的表达模式。

本试验的研究结果对于阐明山羊KLF9基因在山羊肌内脂肪沉积和脂代谢过程中的作用及相关机制起到了重要的作用，提供了新的数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

主要材料与试剂：DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)购自北京Axygen公司(中国)，Ⅱ型胶原酶、油酸购自Sigma公司(美国)，血清购自Gemini公司(美国)，胰蛋白酶和DEME/F12培养基购自Hyclone公司(美国)。反转录试剂盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)购自Thermo公司(美国)，总RNA提取试剂盒、DH5α感受态细胞、2×GC-rich PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司(中国)。TRIzol、SYBR®Premix ExTaqTM(2×)、pMD-19T Vector购自北京TaKaRa公司(中国)。

1.2 样品采集和总RNA提取

选取健康的简州大耳羊(四川省简阳市)和藏山羊(四川省若尔盖县)各4只。清晨空腹屠宰后，当即剪取各个组织样品(背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)，每个2 g，用DEPC水清洗后将各个组织样品分装冻存管内并标好编号放液氮中。

用TRIzol法提取上述各个组织的总RNA。用NanoDrop ND-1000 (Agilent) 分光光度计测定RNA样品的浓度以及OD260/280值，用琼脂糖凝胶变性电泳检测RNA完整性，保留OD260/280值在1.9～2.1且电泳条带清晰的样品。用gDNAse去除DNA后，参照反转录试剂盒说明书制备cDNA。

1.3 山羊KLF9基因的克隆

选取简州大耳羊与藏山羊各1只，以脾脏组织的cDNA为模板，根据GenBank中登录的牛(NM_001193214.1)的KLF9基因序列，利用Primer premier 5.0 设计克隆引物，上游引物：5′-TAGTCCGAGGCCAGGGCA-3′，下游引物：5′-TGTCTGTCTGTTCGCTGGGA-3′，预测长度为891 bp，克隆扩增体系共25 μL：ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×GC-rich PCR Master Mix 12.5 μL(PCR反应条件：94 ℃预变性 4 min；94 ℃ 变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1.5 min，39个循环；72 ℃延伸10 min)。

制备1%琼脂糖凝胶，并对所有样品进行电泳条带检验。将条带清晰明亮的样品切胶回收DNA片段并连接pMD-19T载体，然后转化DH5α感受态细胞。用PCR检验阳性菌落的目的条带，最后将带有纯净明亮的目的条带的菌液样品送公司测序(成都擎科梓熙生物技术有限公司)。

1.4 序列的生物信息学分析

山羊KLF9基因的开放阅读框使用ORF Finder网站进行分析；山羊KLF9基因测序结果使用在线软件Blast对其进行同源性分析；山羊、牛、人、小鼠、猪的氨基酸序列用DNAMAN软件进行相似性比对；对KLF9蛋白质二级结构用在线工具PRABI进行预测；山羊KLF9基因三级结构用PHYRE2在线工具预测比对；KLF9蛋白质量(MW)和等电点 (PI) 使用EXpASy在线工具进行分析；用STRING工具在线预测山羊KLF9蛋白质的相互作用网络(http：//www.string-db.org/)；KLF9蛋白质的亲水性结构用ProtScale在线工具进行分析；KLF9蛋白质跨膜结构用TMPRED在线工具进行分析；KLF9的基因进化树利用MEGA 7软件进行构建。

1.5 实时荧光定量PCR(qPCR)

山羊KLF9基因的特异性引物(由Primer premier 5.0软件设计)为：上游：5′-GGATACCTGGAA GGATTACTGC-3′，下游：5′-GGAAGGACTCGACCCAG

ATT-3′。qPCR程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39个循环。简州大耳羊和藏山羊的样品每一种各设计4个生物学重复，每个待测样本设3个技术重复，阴性对照为3个无cDNA模板的样本，内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(GenBank登录号：XM_005680968)。内参引物为：F：5′-GCAAGTTCCACGGCACAG-3′，R：5′-TCAGCACCAGCATCACCC-3′。

1.6 山羊肌内前体脂肪细胞的分离及原代培养

选用羔羊背最长肌为材料(来自2只简州大耳羊7日龄羔羊)，用胶原酶消化法获得羔羊肌内前体脂肪细胞。剪碎脂肪组织并将其转入离心管(离心管中提前加入2倍体积Ⅱ型胶原酶)，将离心管至于37 ℃水浴锅中1 h进行消化，然后每隔5 min将其摇晃 1次直至其消化完全，而后加入等体积的DME/F12培养基(含10%胎牛血清)终止消化，并用细胞筛过滤(76，37 μm)。将滤液经2 000 r/min，5 min离心，之后弃上清液，并加入适量红细胞裂解液去除红细胞，并将沉淀吹散。静置5 min，放入离心机经2 000 r/min离心5 min。之后弃上清，加DME/F12培养基(含10%胎牛血清)制成细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，4 h后换液，此后每2 d换一次液。

1.7 数据分析

采用2-ΔΔCt法对qPCR数据均一化处理，利用Pasw statistics 18的LSD与Duncan法对数据进行单因素方差分析，用GraphPad Prism 5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 山羊KLF9基因生物信息学分析

利用RT-PCR方法克隆得到山羊KLF9基因序列(模板为简州大耳羊和藏山羊脾脏组织cDNA)。结果得到山羊KLF9基因序列为891 bp，其中包含CDS区735 bp，5′UTR序列86 bp，3′UTR序列70 bp。其终止密码子为TGA，编码244个氨基酸。提交GenBank获得简州大耳羊KLF9基因序列登录号为KX247670，藏山羊登录号为KY849591。简州大耳羊KLF9基因CDS区序列与藏山羊相比具有2个突变，其中第57个碱基由G突变为C，但此处并没有引起氨基酸的改变，属无义突变；第653个碱基由C突变为T，此处引起第218个氨基酸的改变，山羊为脯氨酸(P)，藏山羊为亮氨酸(L)。简州大耳羊与藏山羊KLF9氨基酸序列相似性为99.73%。山羊KLF9氨基酸序列与牛、猪、鼠、人的相似性极高，为99.18%～97.54%(图1)。

山羊KLF9蛋白质量(MW)为27.176 58 kDa，等电点PI为8.80，包含31个负电荷氨基酸碱基(Asp+Glu)和37个正电荷氨基酸碱基(Arg+Lys)，其丝氨酸Ser (S)所占的比例最高，为11.5%。不稳定指数为57.89，属于不稳定蛋白，在哺乳动物细胞中的半衰期为30 h。脂溶系数为52.83，总平均亲水性为-0.857。山羊KLF9蛋白具有1次跨膜结构，位于3-24。KLF9蛋白质二级结构预测结果显示，α螺旋：26.63%，延伸链：13.11%，无规卷曲：60.66%，山羊KLF9的3个锌指结构位置依次为143-167,173-197,203-225。其三级结构在山羊、牛、人、小鼠、猪等物种间具有较高的相似度且具有锌指家族的典型特征(图2)。蛋白质互作网络显示，山羊KLF9可能与KLF6、SMARCA2、SMARCA4、HDAC2、PCAF等蛋白存在互相作用(图3)。

2.2 构建山羊KLF9氨基酸系统进化树

为了研究山羊KLF9氨基酸的进化过程，分别选择哺乳动物、禽类和鱼类的氨基酸序列与之进行生物进化树分析。结果如图4，其中简州大耳羊与藏山羊关系最近，山羊的KLF9基因与牛、猪、猫的KLF9基因具有最近的亲缘关系，猩猩、人、狗、小鼠、大鼠的KLF9基因亲缘关系稍远，与鸡和斑马鱼的亲缘关系最远(图4)。

图1 不同山羊品种(A)和物种间(B)KLF9氨基酸相似性的比对Fig.1 Comparison of KLF9 amino acid similarity between different goat breeds (A) and among various species (B)

图2 不同物种间KLF9蛋白质三级结构的比对Fig.2 Comparison of the tertiary structure of KLF9 protein among different species

图3 山羊KLF9蛋白质互作网络Fig.3 The interaction network of goat KLF9 protein

2.3 KLF9基因在山羊各组织中的表达

qPCR结果显示，KLF9基因的表达在2种山羊间各具特点。KLF9 mRNA在简州大耳羊的各个组织中均有表达，且在皮下脂肪和肝脏组织的KLF9 mRNA的表达量最高，极显著高于其他各组织(P<0.01)；KLF9 mRNA在藏山羊的肺脏组织中的表达量极显著高于其余各个组织(P<0.01)(图5)。

2.4 山羊肌内前体脂肪细胞中KLF9基因的表达

基于KLF9基因在简州大耳羊皮下脂肪组织中的高水平表达，推测其可能在脂肪细胞分化和脂肪沉积中发挥重要调控作用，肌肉组织也是脂肪沉积的部位之一，本试验检测了KLF9基因在诱导前脂肪细胞分化不同阶段(0，2，4，6 d)的表达水平，为阐明其调控山羊肌内脂肪沉积的作用及分子机理提供非常重要的基础数据。结果显示，0～2 dKLF9的相对表达量升高，于2 d达峰值，之后持续下降，且极显著高于诱导分化前(图6)。

图4 KLF9氨基酸系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on KLF9 amino acid with Neighbor-joining method

不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图6同。

图6 山羊KLF9基因在前体脂肪细胞分化过程中的相对表达量Fig.6 Relative expression of goat KLF9 gene during differentiation in preadipocytes adipocytes

3 讨论与结论

已有研究表明KLF9参与3T3-L1前体脂肪细胞生成，比如Pei等[13]指出KLF9调控脂肪细胞分化期阶段PPARγ的转录激活，Kimura等[27]指出KLF9通过增强C/EBPβ的表达来激活3T3-L1早期脂肪生成，但其对山羊肌内前体脂肪细胞分化和脂肪沉积的影响尚未见报道。NCBI上也仅见山羊KLF9预测序列，因此，本项目利用RT-PCR技术克隆山羊KLF9基因序列，并发现简州大耳羊与藏山羊氨基酸序列相似性为99.73%，仅在第218位氨基酸存在差异，生物信息学分析发现山羊KLF9有3个锌指结构，位置依次为143-167，173-197，203-225，符合该家族的结构特征[7]。同源比对和进化树分析发现KLF9在不同物种之间具有极高的保守性。蛋白质结构预测指出山羊KLF9可能与SMARCA2/4[28-29]、HDAC2[30]、PCAF[31]等蛋白存在互相作用，但以上蛋白均与肿瘤的生长与疾病的发生相关。

明确基因的组织表达规律是阐明基因功能的重要基础，本研究利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测了2种山羊各个组织中的山羊KLF9基因表达量。结果发现，KLF9在简州大耳羊和藏山羊的组织表达模式不同，在简州大耳羊的脂肪和肝脏中表达较高，在藏山羊的肺脏组织中表达最高，原因可能是2种山羊生长的环境不同，简州大耳羊主要在四川盆地，而藏山羊在高原，在肺脏组织中高表达可能与高原缺氧适应性有关。焦涛[32]指出KLF9在小鼠肝脏中高表达，王翠喆等[33]发现KLF9基因在维吾尔族网膜脂肪组织中高表达。Antin等[34]发现KLF9在鸡的胚胎发育前期有高表达，Martin等[35]发现其在小鼠胚胎生长发育中也具有高表达。综上所述，KLF9基因表达具有物种和品种特异性。

组织表达谱指出KLF9基因在简州大耳羊的脂肪组织中存在高水平表达，推测其可能参与脂肪沉积。因此，本研究利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测了山羊肌内前体脂肪细胞分化不同阶段的KLF9基因的表达水平，结果发现山羊KLF9基因在肌内前体脂肪细胞中的表达量呈先上升后下降的趋势，其中第2天的相对表达量达到峰值，且极显著高于未诱导分化的前体脂肪细胞，推测该基因可能在山羊前体脂肪细胞分化前期发挥正调控作用。这与Mori等[36]提出的KLF9基因和蛋白在3T3-L1细胞中诱导分化2 d达到峰值的研究结果一致，但是Kimura等[27]的试验结果与此不同，他们指出KLF9基因和蛋白均在3T3-L1细胞诱导分化1 h时达到最高峰值的表达，1 h之后KLF9的表达量呈下降趋势；Pei等[13]则指出KLF9基因和蛋白在3T3-L1细胞诱导分化0～8 d呈逐渐上升趋势。基于本研究所得的结果推测山羊KLF9基因可能在肌内前体脂肪细胞分化早期发挥调控作用，下一步本实验室(青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室)将构建超表达和干扰载体体外转染培养的细胞来进一步证明其调控的作用机制。

本研究克隆得到山羊KLF9基因全长序列891 bp，编码244个氨基酸残基，是不稳定的疏水蛋白，有3个锌指结构。结果显示KLF9基因在简州大耳羊皮下脂肪与肝脏中表达最高，在藏山羊肺脏中表达最高；KLF9在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化2 d表达水平最高，极显著高于未诱导分化的前体脂肪细胞，推测其可能在山羊前体脂肪细胞分化早期阶段发挥调控作用。结果将为进一步了解KLF9基因的功能以及其在肌内脂肪沉积中所起的作用奠定理论基础。

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