简易型同源重组载体pAmpR-NeoR的构建和效果检测

王英泽，王巧兰，曹晴晴，付 育，刘 畅，王晨晨，杜 朝

(河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018)

基因编辑是当前生命科学领域革命性的技术进步，它的建立得益于对细菌适应性免疫机制的深刻认识，以CRISPR/Cas9为代表的基因组修饰技术，可以有效实现对细胞或动植物的基因进行特定修饰(敲除、编辑、激活或阻遏转录、功能基因筛选、基因表观调控等)[1-12]。CRISPR/Cas9编辑系统高效、易于操作和廉价的优点使之迅速应用到生命科学的各个领域[13-16]，除了在医学方面极具诱人前景，这一系统在作物分子育种方面也将大有作为。有学者指出，只要靶点恰当，Cas9在植物中会有较高的编辑效率和特异性[17-19]，并且转基因植物的后代通过自交和回交等手段，容易克服脱靶问题。最近，我国科学家利用单碱基编辑技术成功创制非转基因抗除草剂拟南芥[20]，就是基因编辑技术在植物育种方面的成功范例，相对传统诱变方式创制抗除草剂点突变，基因编辑技术表现出效率高、周期短、成本低的特点，而且可以克服产生连锁的不良突变问题。

CRISPR/Cas9系统的基本机制是CRISPR相关的核酸内切酶(CRISPR-associated endonuclease)Cas9 在指导RNA(Guide RNA，gRNA)的指导下，对基因组上的靶序列进行切割，产生双链断口(Double strand break，DSB)。DSB随后由2种广泛存在的修复途径中的一种修复：一种是有效而易错的非同源末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)途径，这一途径将DSB重新连接，但常常导致在双链断口处小核苷酸片段的插入缺失(Insertions or deletions，indels)，其中有些会导致靶基因失活，形成基因敲除。另一种途径是效率较低但高保真的同源指导修复途径(Homology Directed Repair，HDR)。HDR可以用来按研究人员意志在靶位点引入特异的序列变化，形成基因编辑(Gene edit)。为了进行基因编辑，除了Cas9和gRNA这2个组分之外，还需要一个外源的修复模板，修复模板必须含有目的序列。

质粒是常用的修复模板形式，由于它含有目的序列，所以称作供体质粒(Donor plasmid)，又因为编辑的分子机制是同源重组，所以也称作同源重组载体。构建同源重组载体时，一般首先以PCR扩增得到紧邻靶序列的上下游各约500～750 bp的片段(称作5′、3′同源臂或左右同源臂)，然后分别克隆至同源重组空载体上目的序列的两侧。目前，这类空载体有很多，一般具有2个正选择基因和一个负选择基因；所用克隆方法有多种，有的采用经典的酶切-连接方法，有的采用方便目的片段在各种表达载体之间穿梭的Gateway方法，有些采用适合文库构建的USER(Uracil-specific excision reagent)方法[21]。有些分子生物学试验，比如基因功能初步鉴定，只需敲除目的基因就能够满足要求，通过在目的基因引入便于筛选的NeoR就能实现。因此，利用现有载体pcDNA3.1(+)-HA-His的原核筛选标记AmpR基因、复制原点和真核筛选标记NeoR基因构建了一个新的同源重组载体pAmpR-NeoR，并在NeoR两侧分别引入了一个克隆位点。结果显示，运用这一载体构建供体质粒，与CRISPR/Cas9系统共转染B16细胞，药物筛选14 d后，Junction PCR检测发现NeoR整合到靶序列，实现了编辑。同时，载体的克隆位点是应用便利的BamH Ⅰ和XhoⅠ位点，使其具有序列通用性、良好的扩展性和灵活性，便于根据需要进行改造，以满足具体试验的不同要求。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 质粒载体与细胞株 质粒pcDNA3.1(+)-HA-His、pST1374-N-NLS-Flag-linker-Cas9-BSD(简称pST-Cas9)和pGL3-U6 sgRNA-PGK-Puro mut BsaI ACCG(简称pGL3-U6 sgRNA)，以及小鼠黑色素瘤细胞B16均为河北科技大学细胞工程研究室保存。

1.1.2 试验试剂 2×Pfu PCR StarMix with Loading Dye和2×TaqPCR StarMix with Loading Dye(康润诚业，北京)；限制性内切酶XhoⅠ、BamH Ⅰ、BglⅡ与小牛碱性磷酸酶(CIAP)(宝生物，大连)；T4DNA连接酶、Trans1-T1 感受态细胞(全式金，北京)；质粒小提、普通DNA产物纯化、琼脂糖凝胶DNA回收和血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)；DMEM培养基(Gibico)；胎牛血清(Hyclone)；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen)。

1.1.3 引物与寡核苷酸 扩增NeoR基因的引物(下划线表示酶切位点，下同)：NeoR上游5′-CGGGATCCCTGTGGAATGTGTGTCAGTT-3′(BamH Ⅰ)，NeoR下游5′-CCGCTCGAGCAGACATGATAAGATACATTG -3′(XhoⅠ)，扩增长度1 523 bp；扩增ori-AmpR的引物：AmpR上游5′-CCGCTCGAGGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATT-3′(XhoⅠ)，AmpR下游5′-CGGGATCCTGTGCGCGGAACCCCTATTTGT-3′(BamH Ⅰ)，扩增产物扩增长度1 939 bp；扩增左侧同源臂的引物：左臂上游：5′-GAAGATCTGGGCAGGCACAGTGGGGGGTTA-3′ (BglⅡ)，左臂下游：5′-CGGGATCCCTGCTGCATGGCACCCAGCC-3′(BamH Ⅰ)，扩增长度约620 bp；扩增右侧同源臂的引物：右臂上游：5′-CCGCTCGAGATCTTCTGGGTAGACAGCAGTGCCAC-3′(XhoⅠ)，右臂下游：5′-CCGCTCGAGAACTCTCTTTGAGGGCGTGTGCG-3′ (XhoⅠ)，扩增长度约570 bp；5′ Joinction PCR引物：左臂前-NeoR上游：5′-TGGGAAAGTAATGGGAACCGAGA-3′，左臂前-NeoR下游：5′-GCGGAGAATGGGCGGAACTG-3′，扩增长度1 244 bp；3′ Joinction PCR引物：NeoR-右臂后上游：5′-GCGGGACTCTGGGGTTCGAAATG-3′，NeoR-右臂后下游：5′-GGCAACCCCCAACCATAAAATGA-3′，扩增长度1 025 bp；构建表达gRNA(针对FasL)载体所用寡核苷酸：5′-ACCGCTGGGGACATGGGTAATTCA-3′，5′-AAACTGAATTACCCATGTCCCCAG-3′。

1.2 试验方法

1.2.1 PCR 50 μL体系的模板用量：质粒为100 ng，基因组DNA为1.5 μg。

各片段的扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s；退火温度因片段不同而异，时间均为30 s；延伸72 ℃，时间设定根据是pfu每分钟扩增500 bp，普通Taq每分钟扩增1 kb；72 ℃再延伸5 min。扩增NeoR、ori-AmpR、左侧同源臂、右侧同源臂、5′Joinction和3′Joinction的退火温度分别是：61，61，60，60，61，57 ℃。循环数一般为30，5′Joinction和3′ Joinction PCR的循环数为35。以上PCR反应除Joinction PCR使用的是普通Taq，其他均使用pfu。

菌落PCR：直接挑取少量菌落加入PCR体系作为模板，使用普通Taq扩增。

扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s；72 ℃再延伸5 min；循环数一般为30。

1.2.2 酶切与连接XhoⅠ单酶切或其参与的双酶切均过夜。BamH Ⅰ和BglⅡ酶切时间不少于3 h。

15 μL 连接体系中外源片段和载体按摩尔比约为7∶1，DNA总用量为150～200 ng，16 ℃过夜。

1.2.3 细胞培养与转染 B16细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养。

进行基因编辑时，pST-Cas9、pGL3-U6 sgRNA和本试验构建的同源重组载体pAmpR-NeoR-FasL(或pAmpR-NeoR)按照摩尔比1∶4∶1转染，六孔板每孔质粒总用量约5 μg，转染后48 h使用G418筛选(工作浓度1 mg/mL)，每2 d换液，14 d后收获细胞混合克隆，提取基因组。

2 结果与分析

2.1 同源重组载体pAmpR-NeoR的构建

构建同源重组载体pAmpR-NeoR的总体思路是：利用真核表达载体pcDNA3.1(+)-HA-His的抗氨苄青霉素基因Ampicillin(以下简称AmpR)、原核复制原点pUCori(以下简称ori)和抗新霉素基因Neomycin(包括其前后的SV40启动子和加尾信号，以下简称NeoR)分别作为目的载体的原核选择标记、复制原点和真核筛选基因。为了在正选择标记NeoR两侧引入克隆位点，用于左、右同源臂的克隆，分别扩增AmpR-ori片段和NeoR片段，通过引物在PCR产物两端引入酶切位点，当扩增片段连接到目的载体后，NeoR两端就具备了克隆位点。构建流程如图1-A示意。

A.构建流程的示意图；B.PCR扩增得到的AmpR-ori和NeoR，条带位置正确；M.DL2000 Marker；C.连接体系转化感受态细胞得到若干转化子，挑选其中4个，提取其质粒，质粒以BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，鉴定重组子，M.DL2000 Marker。

A.The schematic diagram of the vector construction process；B.AmpR-oriandNeoRobtained by PCR amplification were seperated by agarose gel electropherosis，and the corresponding bands were in the right position,Marker was DL2000；C.The plasmids extracted from four transformants were cleavaged withBamH Ⅰ andXhoⅠ to identify recombinant,Marker was DL2000.

图1pAmpR-NeoR的构建
Fig.1TheconstructionofpAmpR-NeoR

首先，以pcDNA3.1(+)-HA-His为模板，分别扩增其上的AmpR-ori和NeoR；PCR产物经过纯化，完成Buffer转换，然后均以BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切；酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，由图1-B可见，目的条带位置正确(约1 940，1 530 bp)，切胶回收目的条带。

接下来，将回收的酶切产物连接；连接产物转化感受态细菌，有正常菌落生成，表明转入其中的AmpR-ori为环状分子或环状分子的一部分，而且仍能正常发挥作用，ori使转入的环状分子可以复制，AmpR赋予细菌氨苄抗性，符合目的载体的要求。挑选了4个转化子，提取其质粒，质粒以BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，进行重组子鉴定。结果如图1-C所示，酶切产生2个片段，大小符合预期(约1 940，1 530 bp)，所以4个转化子中转入的均是正确的重组子，选取1号重组子，记作pAmpR-NeoR，进行后续试验。

2.2 pAmpR-NeoR-FasL的构建

为检测pAmpR-NeoR是否能够用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑，选取小鼠FasL基因的第一个外显子中一段序列作为待编辑位点，构建了针对这一靶位点的同源重组载体pAmpR-NeoR-FasL，构建流程示意如图2-A。首先，以XhoⅠ酶切pAmpR-NeoR，酶切产物经过纯化，然后去磷酸化，再以琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段大小符合预期(约3 500 bp)，切胶回收(图2-B)。接下来，以B16细胞基因组为模板，PCR扩增紧邻靶位点下游长度约570 bp的片段，作为右侧同源臂(以下简称右臂)；PCR产物纯化后用XhoⅠ酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离，目的条带位置正确，切胶回收目的条带(图2-C右侧泳道)。

A.构建流程的示意图；B～E.pAmpR-NeoR-FasL(R)的构建：B.XhoⅠ酶切得到线性pAmpR-NeoR，条带位置正确；Marker为DL15000；C.扩增得到左、右同源臂，条带位置正确，Marker为DL2000；D.菌落PCR鉴定重组子右侧同源臂的方向，Marker为DL15000，N为阴性对照，即以水作为PCR模板；E.BamH Ⅰ酶切鉴定右臂方向正确的重组子大小，Marker为DL15000；F～H.pAmpR-NeoR-FasL的构建：F.BamH Ⅰ酶切得到线性化的pAmpR-NeoR-FasL(R)，条带位置正确，Marker为DL15000；G.菌落PCR鉴定重组子左侧同源臂的方向，Marker为DL15000，N为阴性对照，即以水作为PCR模板；H.BamH Ⅰ 酶切鉴定左臂方向正确的重组子的大小，Marker为DL15000。

A.The schematic diagram of the vector construction process；B-E.The construction of pAmpR-NeoR-FasL(R)：B.Linear pAmpR-NeoRobtained byXhoⅠ digestion was seperated by agarose gel electropherosis，and the corresponding bands was in the right position,Marker was DL15000；C.Amplification products of left and right homologous arms were in the correct band position，Marker was DL2000；D.The direction of the right homologous arm of the recombinants was identified with colony PCR，Marker was DL15000，N was negative control (ddH2O) for PCR template；E.The size of the recombinant with right arm in correct direction was verified byBamH Ⅰ digestion,Marker was DL15000；F-H.The construction of pAmpR-NeoR-FasL:F.The position of Linear plasmid pAmpR-NeoR-FasL(R) cut byBamH Ⅰ was correct,Marker was DL15000；G.The direction of the left arm of the recombinants was identified with colony PCR,Marker was DL15000.N was negative control (ddH2O) for PCR template;H.The size of the recombinant with left arm in correct direction was verified byBamH Ⅰ digestion，Marker was DL15000.

图2pAmpR-NeoR-FasL的构建
Fig.2TheconstructionofpAmpR-NeoR-FasL

将回收的线性化空载体与右臂连接，连接产物转化感受态细菌，挑选6个转化子，鉴定重组子。由于右臂克隆至载体采用的是插入型，所以要鉴定重组子中右臂的方向。使用NeoR上游和右臂下游这对引物进行菌落PCR，如果方向正确，会扩增得到长度约2 090 bp的产物，若方向不正确，则无扩增产物。结果显示，1号重组子正确(图2-D)；进一步使用BamH Ⅰ酶切该重组子，得到长度约为4 030 bp的产物，与预期吻合(图2-E)，这样，得到含有方向正确的右臂重组载体，记作pAmpR-NeoR-FasL(R)。

接下来，以BamH Ⅰ 酶切pAmpR-NeoR-FasL(R)，酶切产物纯化、磷酸化和凝胶电泳步骤同上，条带位置正确，切胶回收(图2-F)。同时，以B16细胞基因组为模板，PCR扩增紧邻靶位点上游长度约620 bp的片段，作为左侧同源臂(以下简称左臂)，纯化的PCR产物用BglⅡ和BamH Ⅰ 酶切、电泳，目的条带位置正确，切胶回收目的条带(图2-C左侧泳道)。

连接回收的线性载体和左臂，转化细菌，挑选8个转化子。使用左臂上游和NeoR下游这对引物进行菌落PCR，鉴定左臂方向正确的重组子。如果方向正确，会扩增得到长度约2 140 bp的产物，若方向不正确，则无法扩增。结果显示，8号重组子正确(图2-G)；进一步使用BamH Ⅰ酶切这个重组子，得到长度约为4 650 bp的产物，与预期吻合(图2-H)。这样，得到含有方向正确的左、右臂的重组载体，记作pAmpR-NeoR-FasL。

2.3 pAmpR-NeoR-FasL指导编辑

接下来，对pAmpR-NeoR-FasL指导基因编辑的能力进行检测。如果可以指导编辑，同源重组载体上位于左右同源臂之间的NeoR基因就有机会整合进靶序列。设计了针对靶序列的Oligo，按照Su等[22]的方法，构建pGL3-U6 sgRNA-FasL(图1)。把pST-Cas9、pGL3-U6 sgRNA-FasL与pAmpR-NeoR-FasL(或空载体pAmpR-NeoR)共转染B16细胞，经过G418筛选14 d后，提取基因组，采用Junction PCR方法检测基因编辑情况。图3-A、B显示，5′和3′Junction PCR产物长度符合预期，提示NeoR基因插入位点正确；对Junction PCR产物测序，结果进一步肯定NeoR基因确实定点整合进靶序列(图3-C)。这表明，构建的pAmpR-NeoR可以作为同源重组载体，通过将靶位点上下游序列克隆至载体的NeoR基因两侧，可以按研究人员意志将NeoR基因整合进靶位点，实现编辑。

使用CRISPR/Cas9系统和同源重组载体转染B16细胞，经过14 d筛选得到混合克隆，提取其基因组DNA，分别进行：A.5′Junction PCR；B.3′Junction PCR，PCR产物长度均符合预期(1 244 bp和1 025 bp)；V.空载体pAmpR-NeoR；F.供体质粒pAmpR-NeoR-FasL；M.Marker DL 2000；C.Junction PCR产物的测序结果，进一步肯定NeoR基因确实定点整合进靶位点。

B16 cells transfected with CRISPR/Cas9 system and homologous recombinant vectors were screened for 14 days.The genomes DNA of the stable pool were extracted for the next experiment:A.5′Junction PCR;B.3′Junction PCR，and the sizes of these PCR products are as expected 1 244 bp and 1 025 bp，respectively;V.The empty vector pAmpR-NeoR;F.The donor plasmid pAmpR-NeoR-FasL;M.DL2000 Marker;C.The results of the sequencing of the Junction PCR products further confirmed thatNeoRgene was indeed integrated into the target site.

图3pAmpR-NeoR-FasL可以指导基因编辑
Fig.3pAmpR-NeoR-FasLcouldguidegeneediting

3 讨论

在试验中成功构建了一个相对简易但有效的同源重组空载体pAmpR-NeoR，在此基础上构建的供体质粒pAmpR-NeoR-FasL可以准确地将目的序列NeoR整合进靶序列。相对于一般的同源重组载体，pAmpR-NeoR只有正选择标记，而没有供排除随机整合的负选择标记，所以，只是在混合克隆水平对其进行了功能的验证。如果挑选发生编辑的单克隆，使用该载体比使用具有正负筛选标记的供体质粒工作量要大。所以，该载体只能适合于对于功能进行初步鉴定等试验使用。正是考虑到这一点，在构建空载体时，在克隆位点的选择上采用了BamH Ⅰ和XhoⅠ这2个酶的酶切位点。

BamH Ⅰ与BglⅡ是同尾酶，XhoⅠ与SalⅠ是同尾酶，以BamH Ⅰ和XhoⅠ作为克隆位点，这使得pAmpR-NeoR有3个优点。一是基本能保证载体对于靶序列的通用性。因为同源臂长度在700 bp左右，在这样长度的序列中，左臂同时具有BamH Ⅰ和BglⅡ的几率极低，同样右臂同时具有XhoⅠ和SalⅠ的几率也极低，因而pAmpR-NeoR几乎可用来构建针对任何序列的供体质粒。二是保证了pAmpR-NeoR具有良好的扩展性。本试验中，左臂5′端使用了BglⅡ位点，与线性化载体的BamH Ⅰ位点连接之后形成焊死位点；而3′端使用了BamH Ⅰ，与载体的BamH Ⅰ位点连接之后仍然形成BamH Ⅰ位点，这个BamH Ⅰ位点可用作绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆，而EGFP基因可作为便于镜下观察的正选择标记。同样，如果右臂5′端采用SalⅠ与载体上的NeoR基因3′端焊死，3′端采用XhoⅠ，连接载体之后仍形成XhoⅠ位点，便可用作负选择标记的基因克隆。三是保证了pAmpR-NeoR使用的灵活性，这其实是上述2个优点的综合体现。比如，若右臂具有XhoⅠ或SalⅠ，负选择基因则无法在其下游克隆，则可以克隆在左臂上游。当然这需要将左臂的3′端与NeoR的5′端焊死，5′端仍与载体形成BamH Ⅰ位点。

综上所述，构建的pAmpR-NeoR对于功能初步鉴定等试验具有一定的应用价值，其优势主要体现在该载体具有序列通用性、良好的扩展性和灵活性，便于根据需要进一步改造，以满足具体试验的不同要求。

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