GPR37调节巨噬细胞的吞噬功能并参与炎症痛的消退

研究背景

炎症的主要有五大表现：红、肿、热、痛和功能丧失。作为炎症最主要的特征，疼痛通过向大脑发出警告（伤害性）信号并触发逃避反应来保护炎性组织。与此同时，外周神经系统中的伤害性感受器也同步激活，通过产生神经肽（如P物质）和趋化因子（如CCL2）等引起神经源性炎症和神经炎症。组织损伤后的炎症会导致免疫细胞的募集并且进入受损部位。根据细胞种类的不同，不同的细胞进入受损组织的速度也不同：中性粒细胞可以在在几小时内进入受损的组织，而巨噬细胞往往需要几天。这些免疫细胞产生炎症介质，如促炎细胞因子 (TNF-α，IL-1β)，通过与皮肤、肌肉和关节组织伤害感受器上的细胞因子受体结合而引起炎症性疼痛。可控的炎症具有生理性保护功能，适度炎症是为了消除细胞损伤的最初诱因，促进组织修复进而恢复内环境的稳态。急性炎症的消退是一个活跃的过程包括SPMs(specialized proresolving mediators) 的产生。SPM相比较于吗啡，可以以更低剂量显著抑制炎性痛。值得一提的是，由DHA合成的PD1 (protectin D1) 和NPD1(neuroprotectin D1) 可以通过对神经元、免疫细胞和胶质细胞的多重作用，有效抑制炎症反应和炎性痛。

研究证明SPMs可以通过促进吞噬清除炎症反应的病原体和细胞碎片以消退炎症。在哺乳动物免疫系统中，吞噬反应是由免疫细胞与PAMPs (pathogen-associated molecular patterns)的接触所激活，如酵母聚糖。巨噬细胞在吞噬中发挥至关重要的作用，并且表现出不同的亚型，如促炎的M1型和抑炎的M2型。但是，巨噬细胞吞噬和表型改变的信号通路和分子机制仍未完全阐明。

GPR37是一种parkin蛋白的底物，高表达于脑，并与脑神经紊乱性疾病如帕金森病和孤独症等密切相关。GPR37还可与多巴胺转运体结合参与调节多巴胺的摄取。也有研究表明GPR37基因突变与孤独症谱系障碍密切相关。然而，GPR37在免疫细胞的作用仍未阐明。本研究发现GPR37表达于巨噬细胞而不是小胶质细胞，并且证明GPR37是NPD1的潜在受体，在NPD1诱导的巨噬细胞胞内钙离子信号和吞噬中发挥必不可少的作用。GPR37基因缺失的巨噬细胞中NPD1的功能被取消。因此，本研究得出结论：GPR37在巨噬细胞介导的炎症痛的消退中至关重要。

主要研究结果

作者首先利用免疫组织化学的方法，检测了GRP37的组织与细胞分布情况。IHC结果显示，GPR37定位于小鼠后足皮肤的真皮层，双标染色结果显示GPR37主要与巨噬细胞标记物CD68共标，而与小胶质细胞标记物CX3CR1没有共标，LacZ染色也没有发现表达GPR37的细胞核与IBA-1（小胶质细胞标记物）共标。因此GPR37表达于巨噬细胞，而不是小胶质细胞。

作者接下来考察了细胞内钙离子浓度的改变是否与GRP37有关。首先作者构建了GPR37的表达载体并且转染到HEK293细胞上，接下来对过表达GPR37的HEK293细胞进行钙成像，发现TX14和NPD1均可以显著增加iCa2+。而在巨噬细胞中NPD1诱导的iCa2+增加在GPR37基因缺失的巨噬细胞中被取消。以上数据可以证明NPD1通过GPR37诱导巨噬细胞和HEK293细胞iCa2+增加。

作者接下来考察了GPR37对于巨噬细胞吞噬功能的影响。作者采用了荧光标记的酵母聚糖颗粒吞噬法检测了巨噬细胞的吞噬活性。结果显示NPD1可以剂量依赖性的增加吞噬活性，并且在GPR37基因缺失的巨噬细胞中被取消。进一步研究证明NPD1诱导的吞噬可以被钙离子螯合剂、PTX、ERK信号通路抑制剂和PI3K/AKT抑制剂所抑制。所以，NPD1可能是通过GPR37，iCa2+，PI3K/AKT和ERK信号通路诱导巨噬细胞的吞噬。

在离体水平的实验结果并不一定在整体动物水平中可以被重现出来，因此作者进一步采用了小鼠模型来进一步验证GPR37对于巨噬细胞吞噬功能以及炎症消退的结果。在小鼠后足足底注射荧光标记的酵母聚糖颗粒制备炎症痛模型，观察水肿时间，免疫细胞（巨噬细胞和中性粒细胞）的浸润和巨噬细胞吞噬酵母聚糖的情况。水肿发生于2 h，4 h达峰，之后稍有降低并持续1天，第8天完全恢复。IHC结果显示免疫细胞的浸润，最早发生浸润的是中性粒细胞，之后是巨噬细胞。双重免疫染色结果显示吞噬的酵母聚糖主要定位于表达GPR37的巨噬细胞，Gpr37-KO小鼠中吞噬的酵母聚糖水平显著降低。

酵母多糖增加WT小鼠炎性皮肤Il1b mRNA水平和IL-1β蛋白水平，但是在Gpr37-KO小鼠中增加程度更高。同时，酵母多糖可以从mRNA和蛋白水平增加WT小鼠炎性皮肤抗炎因子IL-10和TGF-β水平，但在Gpr37-KO小鼠中作用被取消。GPR37通过抑制酵母多糖激活的巨噬细胞促炎因子(IL-1β)的表达和促进抗炎因子 (IL-10，TGF-β)的表达调节巨噬细胞的表型。

通过足底注射联合应用WT 巨噬细胞和IL-10的抗体阻断巨噬细胞的IL-10。发现WT 巨噬细胞移植到GPR37缺陷小鼠中可促进炎性疼痛的消退。这一结果表明，WT 巨噬细胞可能通过IL-10分泌参与炎症痛的消退。

讨 论

本研究首次揭示了GPR37表达于巨噬细胞，而不是小胶质细胞。GPR37作为NPD1的潜在受体，在NPD1诱导的巨噬细胞吞噬过程中发挥了关键性作用。GPR37分子是NPD 1诱导的巨噬细胞内Ca2+信号转导和吞噬所必需的。NPD 1的这些作用在GPR 37缺乏的巨噬细胞中被取消。本研究发现GPR37另一个重要作用是调节巨噬细胞表型。表达GPR37的巨噬细胞表现出更多的M2型而不是M1型，产生低水平的IL-1β和高水平的IL-10和TGF-β，进而导致炎症的消退。因此，药理学上增强吞噬能力和巨噬细胞表型的转化在治疗慢性炎症性疾病和慢性疼痛上有巨大潜力。

炎症的主动消退已成为一种新型的炎症痛治疗策略。以往研究的转化落脚点不足。而本研究不仅为炎症的消退提供了一个在巨噬细胞上而不仅仅是小胶质细胞上的靶分子-GPR37，并且还证明GPR37对巨噬细胞介导的炎性疼痛的解决至关重要；还进一步找到了调节GPR37分子的药物先导化合物，一个来自于鱼油的衍生物NPD1。 用NPD1或其他仿制药或GPR37的小分子激动剂特异性靶向巨噬细胞GPR37，很可能成为治疗炎症痛和其他炎症相关疾病的关键手段。

利用巨噬细胞而不是杀伤巨噬细胞来“退炎镇痛”在未来可能成为新的镇痛药物研发策略。