肉牛阴道益生乳酸菌功能性评价

杨雨江 ， 王 军 ， 孙铭韩 ， 周亚宽 ， 杨连玉 ， 吕文发

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118 ; 2.长春市科技学院 ， 吉林 长春 130600 ;3.长春市九台区畜牧局 ， 吉林 长春 130500)

子宫内膜炎等生殖道感染疾病是母牛产后十分常见的一类产科疾病，严重影响母牛的繁殖性能，同时患病牛饲料消耗和治疗费用的增加严重制约了养牛业的健康发展。目前对于该病的治疗普遍采用抗生素疗法，但长期使用抗生素会造成细菌耐药性的产生、药物残留等问题，因此生产中急需抗生素替代品治疗母牛产后子宫内膜炎。微生态制剂具有无毒、无害、无污染等特性得到了广泛关注，并已成功应用于防治肠道疾病的发生。已有相关研究报道表明，乳酸菌是牛生殖道内的优势菌群[1-3]，乳酸菌可通过产生酸性物质维持生殖道较低的pH值[4]，并通过分泌过氧化氢有效地防止病原菌的入侵[5]，与病原菌竞争粘附上皮细胞形成防御病原菌入侵宿主的生物屏障[2]。因此，微生态制剂防治牛子宫内膜炎，在生产中具有非常重要的意义。以往有关阴道益生乳酸菌的分离筛选大多集中于奶牛，本试验拟从肉牛阴道内分离筛选益生乳酸菌，并对其益生特性进行评价，为微生态制剂的后续开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 乳酸菌分离及鉴定 使用自制内膜活检采样器收集20头产后健康肉牛阴道分泌物，放入新鲜无菌的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养18～24 h，完成菌株的富集。采用乳酸菌培养基完成乳酸菌的分离，并取部分菌液保存备用。

1.2 乳酸菌抑菌性能测试 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌为指示菌，采用牛津杯法测定乳酸菌抑制病原菌生长能力。将牛津杯置于事先准备好的病原菌平板上，并向牛津杯中添加菌液浓度为OD600 nm值= 2.0的乳酸菌上清液，每组设置3个重复，以PBS缓冲溶液为空白对照组，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径。

1.3 抑菌物质特性研究

1.3.1 过氧化氢排除试验 为了排除过氧化氢对抑菌能力的影响，向菌液浓度为OD600 nm值= 2.0的乳酸菌上清液中添加浓度为10 mg/mL过氧化氢酶溶液，35 ℃水浴处理1 h，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法确定乳酸菌的抑菌物质。

1.3.2 细菌素排除试验 为确定细菌素是否为乳酸菌抑菌物质，本研究使用终浓度为1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K室温下混合60 s。测定乳酸菌上清液添加3种酶后抑菌能力的改变。1 mL的乳酸菌上清液中添加3种蛋白酶各100 μL，室温条件下放置1 min。通过牛津杯法测定处理后的乳酸菌上清液的抑菌能力变化。

1.3.3 有机酸排除试验 为确定有机酸是否为乳酸菌抑菌物质，过夜培养的乳酸菌上清液使用1 mol/L NaOH调节乳酸杆菌上清液pH值为7.0，采用牛津杯法测定中和后的乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌能力变化。

1.4 乳酸菌产酸能力测试 将事先保存的乳酸菌活化，接种于已灭菌的MRS培养基中， 37 ℃厌氧静止培养24 h，未接菌的液体培养基作为空白对照。培养期间每隔2 h测量菌液的pH值。最后绘制乳酸菌培养液pH值变化曲线。

1.5 乳酸菌抗生素敏感性测试 采用药敏纸片法测定乳酸菌抗生素敏感性[6-7]。乳酸菌37 ℃过夜培养，100 μL 浓度为107CFU/mL的乳酸菌接种于MRS琼脂培养基上，室温放置20 min，使用无菌镊子将抗生素纸片贴于平板上，每组设置4个重复。37 ℃厌氧培养18 h，测量抑菌圈直径。

1.6 16S rDNA序列分析 提取乳酸菌DNA，采用16S rDNA V3区通用引物(338F:5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′， 518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)进行扩增。PCR反应条件如下：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR扩增完成后, 1%琼脂糖凝胶电泳检测,PCR产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。

2 结果

2.1 乳酸菌抑菌能力 乳酸菌作为奶牛阴道内主要的优势菌群，其最主要的益生功能是抑制病原的生长。因此使用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌为指示菌，测定了乳酸菌分离株的抑菌能力，并完成了乳酸杆菌分离株的初步筛选。从20头健康肉牛阴道内共分离20株乳酸菌，通过抑菌活性试验共从20株分离株中筛选出 6株具有抑菌能力的乳酸菌分离株。如表1所示，其中4株乳酸菌对3种病原菌具有良好的抑菌能力，Y4和Y6对大肠杆菌和沙门菌无抑菌能力，基于抑菌能力检测结果，筛选出Y1、Y2、Y3和Y5进一步研究其益生功能。

表1 乳酸菌抑菌能力测定

2.2 乳酸菌抑菌物质特性 采用不同处理方式处理乳酸菌上清液，通过牛津杯法测定处理后的上清液对金黄色葡萄球菌抑菌能力变化，用来确定乳酸菌抑菌物质特性。由图1可知，当使用过氧化氢酶处理乳酸菌上清液后发现，Y1对金黄色葡萄球菌的抑菌活性显著下降，Y5对金黄色葡萄球菌抑菌活性无显著变化，其余乳酸菌失去抑菌活性，表明过氧化氢酶是Y1、Y2和Y3的抑菌物质。当使用蛋白酶处理乳酸菌上清液后发现，所有乳酸菌抑菌活性无显著变化，表明细菌素不是上述乳酸菌的抑菌物质。当使用NaOH调节乳酸菌上清液pH值为7.0后，所有乳酸菌失去对金黄色葡萄球菌抑菌活性，表明有机酸是上述所有乳酸菌的抑菌物质。

图1 乳酸菌抑菌物质特性分析

2.3 乳酸菌产酸测定结果 4株乳酸菌产酸能力如图1所示。4株菌株在2～16 h之间，培养液pH值迅速下降，6～18 h培养液pH值缓慢下降，随后培养液pH值趋于稳定。从图1可知，Y5产酸能力最强，其余3株乳酸菌产酸能力相近。

图1 乳酸菌产酸能力测试

2.4 乳酸菌抗生素敏感性 采用药敏纸片法测定了4株乳酸菌抗生素敏感性，由表2可知，所有乳酸菌对青霉素、氨苄西林和万古霉素具有良好的敏感性，对庆大霉素具有较高的抗性，对环丙沙星和头孢唑啉表现出不同的抗生素敏感性模式。

表2 乳酸菌抗生素敏感性结果

S:敏感；I：中等敏感；R：抗性

2.5 乳酸菌鉴定结果 提取4株乳酸菌DNA，16S-rDNA V3区通用引物扩增结果显示，扩增产物小于200 bp，符合预期结果。经Blast比对发现，Y1为坚强肠球菌、Y2为屎肠球菌、Y3为酪黄肠球菌，Y5为乳酸杆菌，具体结果如表3所示。

表3 乳酸菌鉴定结果

3 讨论

目前研究表明，乳酸菌是母牛阴道内主要优势菌群，并可通过产生有机酸、过氧化氢和细菌素抑制病原菌生长[8-9]。在本研究中，共从健康肉牛阴道内分离筛选获得4株乳酸菌，并评估了4株乳酸菌的潜在益生功能。本次试验从肉牛阴道内筛选获得酪黄肠球菌和乳酸杆菌(Lactobacillusaqilis)不同于本实验室以往从奶牛阴道内分离获得的乳酸菌。

乳酸菌抑制病原菌生长的能力是筛选益生菌的主要指标，以往研究表明，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌是母牛生殖道感染的主要病原菌[10]，因此本试验采用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌作为指示菌测定了乳酸菌抑菌能力。结果显示，6株乳酸菌中只有4株乳酸菌(Y1、Y2、Y3和Y5)同时对3种病原菌具有抑菌能力。因此选择Y1、Y2、Y3和Y5继续进一步研究。本研究检测乳酸菌上清液不同处理后对金黄色葡萄球菌抑菌能力的影响。当使用NaOH中和乳酸菌上清液后，所有菌株均失去对金黄色葡萄球菌抑菌能力，过氧化氢酶处理乳酸杆菌上清液后，Y1对金黄色葡萄球菌抑菌能力显著下降，Y2和Y3失去对金黄色葡萄球菌抑菌能力。由此可知，有机酸、过氧化氢是坚强肠球菌Y1、屎肠球菌Y2和酪黄肠球菌Y3的主要抗菌物质，而乳酸杆菌(Lactobacillusaqilis)的主要抗菌物质是有机酸。本研究结果与Domitonova报道的相似，当上清液使用NaOH和过氧化氢酶处理后，抑菌能力显著下降[11]。乳酸菌产酸是保护宿主避免病原菌感染的主要途径[4]，在本试验中4株乳酸菌在培养2 h后，培养液pH值迅速下降，并在18 h后培养液pH值趋于稳定。乳酸菌抗生素耐药性得到人们的广泛关注，以往研究报道显示，益生菌耐药基因可转移至其他乳酸菌或病原菌[7]。因此本研究测定了乳酸菌抗生素敏感性，研究结果显示，所有菌株均对青霉素、氨苄西林和万古霉素敏感。结果表明，4株乳酸菌具有一定安全性，可以在临床上应用。但本试验仅限于体外益生功能评价，仍需进一步的临床效果研究加强当前的研究结果。

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