传染性造血器官坏死病病毒的重组及安全效价分析

代 静 , 焦 雪 , 卢玉婷 , 张培军 , 巴翠玉 , 茆安婷 , 李月红

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118 ; 2.吉林省卫生检测检验中心 ， 吉林 长春 130118)

鱼传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis of fish, IHN)是由传染性造血器官坏死病病毒(InfectioushematopoieticnecrosisVirus, IHNV)引起的一种急性的、全身性的鱼类传染病[1]，20世纪50年代初，该病毒在北美洲西部大马哈鱼鱼苗场首次被发现[2]，迅速蔓延到欧洲和亚洲，在鲑类和鳟类鱼中引起了全球流行病[3]。IHNV-G蛋白是能够诱导中和抗体反应的惟一病毒蛋白[4]。发病时以鱼体出血，肾脏和脾脏造血组织坏死为典型特征，IHN的感染造成成鱼死亡率为10%～25%，幼鱼死亡率可达100%[5]。因此研制其免疫效果好、安全性高、成本低廉的新型疫苗成为研究的热点。

目前，对IHNV有效的防控措施是通过隔离病毒或是注射疫苗，但3月龄内的鱼苗其免疫器官未发育成熟[6]，所以注射疫苗往往达不到理想的效果。莱茵衣藻作为光合真核微生物，可准确表达外源基因，生物安全性高，近年来发现莱茵衣藻具有外泌蛋白的能力，可大大降低重组蛋白的后续分离纯化。利用其作为生物反应器研制鱼类口服疫苗具有良好的应用前景[7-8]。本研究主要以研制出安全、可靠的新型载体口服疫苗为目的，为我国的冷水渔业健康发展提供一定的技术支持[9]。本试验将传染性造血器官坏死病病毒主要抗原组分糖蛋白基因重组到莱茵衣藻核表达载体上，构建重组质粒，利用电穿孔技术将该重组质粒转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻中，进行抗性筛选，以获得携带了目的基因的转基因莱茵衣藻。同时，将重组的莱茵衣藻灌喂BALB/c小鼠后进行IHNV安全评价，获得小鼠脾脏细胞后利用流式细胞术检测免疫指标。从而为研制新型、安全有效的IHNV口服疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 IHNV-G基因总RNA的提取 取300 μL细胞毒加1 mL TRIZol室温孵育5 min，12 000 r/min (4 ℃)离心15 min后吸取上清，加入200 μL的氯仿震荡15 s，室温孵育5 min；12 000 r/min(4 ℃)离心15 min；吸取上层转置到一个新的EP管中，加入500 μL的异丙醇沉淀RNA，室温孵育10 min；12 000 r/min(4 ℃)离心15 min；倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤2次，7 500 r/min(4 ℃)离心5 min；室温干燥5 min，加25 μL的无RNA酶处理水溶解并保存在-80 ℃。

1.2 IHNV-G基因cDNA的克隆 以1μL细胞为模板，按照宝生生物(上海)公司提供的反转录试剂盒合成cDNA第一条链，引物根据NCBI数据库中已公开IHNV的HLJ-09株(登录号：JX649101)的G基因序列设计上下游引物，去掉终止密码子后在上游引物中引入EcoRI酶切位点和下游引物中引入KpnI酶切位点：上游引物：5′-TAGATATCATGGACGCCATGATCAC-3′；下游引物:5′-ATGGTACCTATTAGGACCTGTTTGCC-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性5 min；退火温度61 Tm；72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。将PCR产物进行胶回收，按宝生生物(上海)公司提供的胶回收试剂盒进行纯化，连接至DH5α中，挑取白色菌落扩大培养，按照质粒DNA小量提取试剂盒提取，用EcoRI酶、KpnI酶进行双酶切，将阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.3 重组莱茵衣藻的构建 将扩增得到的IHNV-G基因克隆到pMD18T中，然后将其涂布与LB培养基中，隔天挑取单菌落置于LB液体培养基中振荡过夜，按北京索莱宝生物技术有限公司小提质粒试剂盒提取质粒并送至哈尔滨博仕生物技术有限公司测序，然后将测序正确的质粒克隆到pDBle载体上构建PDBle-IHNV-G重组表达载体，经电击法转化到莱茵衣藻中，通过博来霉素抗性筛选得到单克隆转基因莱茵衣藻，用PCR方法检测转基因莱茵衣藻。

1.4 IHNV-G蛋白血清的制备 抗IHNV全血清病毒的制备，取本实验室保存的IHNV细胞毒15 mL，按照2.5 μL/mL加入40%甲醛至终浓度0.1%，37 ℃温育48 h。加入等体积的弗氏佐剂混匀，采用腹腔注射，每只小鼠注射0.25 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，每只小鼠眼球取血约0.7 mL，37 ℃水浴1 h，3 000 r/min(4 ℃)离心10 min，最后血清量约350 μL左右置于-20 ℃保存。

1.5 Westen Blot 将重组的莱茵衣藻表达蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后用蒸馏水冲洗3次，置于转膜缓冲液中平衡5 min准备转膜；转膜结束后，取出PVDF膜，做好标记，用PBS冲洗3次，置于5 %脱脂奶中，4 ℃封闭过夜；次日，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5 min，在加入1∶3 000稀释浓度的鼠源HIS标签抗体作为首抗，室温孵育5 h；TBST漂洗3次，每次5 min；加入1∶2 000稀释浓度的辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG作为二抗，37 ℃孵育1.5 h；TBST漂洗3次，每次5 min。按照DAB显示试剂盒进行显色，显色前将10 mL反应液，200 μL溶液A，100 μL溶液B，20 μL溶液C在棕色瓶中充分混匀，再将PVDF膜浸泡在其中，37 ℃条件下震荡反应5 min，弃去显色液后用蒸馏水冲洗3次，自然干燥后观察记录。

1.6 病毒滴度的测定 按照每cm2最多加入10 μL IHNV病毒的标准将本实验室保存的IHNV病毒加入FHM单层细胞中，16 ℃吸附1 h后换新鲜的M199培养基，置于16 ℃培养，同时设立对照组，每天记录观察。待80%细胞出现病变后，将细胞反复冻融3次，制备病毒悬液备用，进行病毒滴度的测定，TCID50计算采用Karber 法计算，即LgTCID50=L-d(s-0.5)，L是最高稀释度的对数，d是稀释度对数之差，s是阳性孔比率总和。

1.7 BALB/c小鼠的饲养 取6周龄雌性BALB/c小鼠，将小鼠分为4组，每组10只，饲喂同样的鼠粮和水。每日灌胃1次，一次200 μL,第1组灌喂转基因莱茵衣藻，第2组灌喂莱茵衣藻，第3组、第4组灌喂PBS，连续灌喂7 d，每日观察并记录小鼠状态。

灌胃结束后对小鼠进行攻毒试验，第1、2、3组每只小鼠腹腔注射IHNV病毒200 μL，第4组小鼠腹腔注射PBS 200 μL，每日观察并记录小鼠状态。第0、7、14、21、28天，随机选取4只小鼠称重，取平均值。每日观察并记录小鼠状态。

1.8 小鼠脾脏细胞的制备与淋巴细胞亚群的测定 第14天每组随机取4只小鼠，在无菌条件下取小鼠脾脏。在脾脏组织中加1 mL M199细胞培养基，经200目尼龙网过滤于离心管中，2 000 r/min(4 ℃)离心5 min；弃上清，加入500 μL红细胞裂解液重悬脾细胞，避光裂解10 min，2 000 r/min(4 ℃)离心5 min；弃上清，观察细胞沉淀，如果仍然为红的，重复裂解1次；如果细胞沉淀为白色，加入1 mL M199培养基洗涤细胞沉淀，2 000 r/min(4 ℃)离心5 min；弃上清，加 1 mL FACS溶液洗涤细胞沉淀，2 000 r/min(4 ℃)离心5 min；弃上清，加入1mL FACS重悬细胞，进行细胞计数；分装细胞，每管1×106细胞；在加入1 mL FACS洗涤1次，2 000 r/min(4 ℃)离心5 min，加入100 μL FACS即为脾细胞悬液。

取上述制备的脾脏细胞，每管加入抗小鼠PE-CD3e、FITC-CD4、APC-CD8a单克隆抗体各10 μL，同时设置单染对照组和空白对照组，室温避光孵育50 min，然后用FACS冲洗多余抗体，避免影响检测结果，最后用流式细胞仪检测细胞荧光，并用软件分析。

2 结果

2.1 IHNV-G基因总RNA提取结果 待80%细胞出现明显病变，按照TRIZol试剂说明书操作提取细胞毒中FHM细胞和IHNV病毒的总RNA如图1。

图1 FHM细胞和IHNV病毒的总RNA

2.2 IHNV-G基因RT-PCR扩增 以FHM细胞和IHNV病毒的总RNA为模板，反转录合成cDNA第一条链。再以cDNA作为PCR反应的模板，经特异性引物PCR反应后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图2，得到一条1 500 bp左右大小的特异性条带。

图2 PCR扩增结果

M：DL-2 000 Marker； 1和2均为IHNV PCR产物

2.3 莱茵衣藻表达载体的构建结果 将表达载体化学转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行扩增后提取质粒，进行双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证结果如图3，得到1条1 500 bp 左右大小的特异性条带，说明线性化载体与目的片段连接成功，将质粒送至测序公司进行测序，测序结果同样证明载体与目的片段连接成功，插入片段进行同源性比对结果同源性为99%。

图3 表达载体pCh-IHNV-G 酶切结果

M:250 bp DNA Marker ; 1、3、5：pCh-IHNV-G表达载体藻;2、4、6：质粒酶切

2.4 SDS-PAGE电泳分析结果 转基因莱茵衣藻经两次抗性筛选后，离心收集转基因莱茵衣藻，超声波破碎莱茵衣藻提取粗蛋白，进行SDS-PAGE电泳，结果显示，有1条大约为58 kDa的蛋白条带如中插彩版图4，与理论结果相符合。

2.5 Western Blot检测结果 以重组表达的G蛋白为抗原，鼠抗IHNV血清为首抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗，经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应，在58 kDa处出现了一条明显的特异性条带，如中插彩版图5。以重组表达的目的蛋白为抗原，鼠源HIS标签抗体为首抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗，Western Blot结果显示，目的蛋白能与鼠源HIS标签抗体反应，在58 kDa处出现了一条明显的特异性条带，与SDS-PAGE出现的目的蛋白一致如图6。

图6 Western Blot分析

2.6 病毒滴定测定结果 将病毒悬液做10倍倍比稀释后接种到长满单层的FHM细胞的96孔板中，采用Karber 法计算出病毒悬液的TCID50为10-6.2/0.1 mL。

2.7 BALB/c小鼠增重效果 小鼠饲喂同样的鼠粮和水，第1～7天每组每只小鼠每天灌胃，每日灌胃1次，一次200 μL,第1组灌喂转基因莱茵衣藻，第2组灌喂莱茵衣藻，第3组、第4组灌喂PBS，第8天对小鼠进行攻毒，第1、2、3组每只小鼠腹腔注射TCID50效价为10-6.2的IHNV 200 μL，第4组小鼠腹腔注射PBS 200 μL，第0、7、14、21、28天，每组随机选取4只小鼠称重，取平均值。第4组为对照组小鼠体重平稳增长，第3组小鼠灌喂PBS并腹腔注射IHNV，与第4组相比体重增长缓慢，第1组和第2组第1～7天灌喂莱茵衣藻时体重较对照组增长缓慢，将数据进行SPSS统计可得，第1组29.6±0.063ab；第2组26.7±0.31b；第3组22.7±0.03a；第4组23.9±0.64a。由数据可知，腹腔注射IHNV后体重增长明显高于对照组，说明口服莱茵衣藻可增强免疫，促进生长，第1组和对照比，差异极显著；第2组和对照组相比，差异显著；而由图7可知，第1组灌喂转基因莱茵衣藻小鼠体重增长高于第2组，说明转基因莱茵衣藻对小鼠体重变化的影响更为显著。

图7 小鼠平均体重变化

第3组：PBS攻毒组，第4组：PBS组

2.8 小鼠脾脏细胞淋巴细胞亚群的测定结果 将转基因莱茵衣藻，莱茵衣藻，PBS分别给小鼠灌喂，连续灌喂7天，第8天对小鼠进行攻毒，第14天每组随机取4只小鼠，在无菌条件下取小鼠脾脏，并分离制备脾细胞悬液，用抗小鼠PE-CD3e、FITC-CD4、APC-CD8a单克隆抗体孵育后用流式细胞仪进行检测，测定各组小鼠脾中CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群变化情况见表1，淋巴细胞和CD3+T淋巴细胞设门方法如中插彩版图8，结果如中插彩版图9。试验结果显示，灌喂转基因莱茵衣藻组CD4+T淋巴细胞含量极显著高于其他3组，CD8+T淋巴细胞含量与对照组相比也有所增加。转基因莱茵衣藻组和莱茵衣藻组CD4+、CD8+T淋巴细胞含量都有所增加，都能够刺激小鼠体内T淋巴细胞的增值，并且小鼠无死亡现象，证明重组之后的蛋白不能对小鼠产生毒理效应并且能够刺激小鼠的免疫指标升高。

表1 流式细胞仪测定各组小鼠脾中CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群变化情况 (x±s,%)

3 讨论

莱茵衣藻是单细胞真核生物，隶属于绿藻门，团藻目，衣藻属，其结构简单，生产成本低廉，可作为鱼类的天然饵料[10-12]。本实验室构建的重组莱茵衣藻通过IHNV病毒的糖蛋白基因插入到pChlamy-4载体上构成pCh-IHNV-G重组质粒，经大肠杆菌TOP10感受态细胞的扩增后，提取质粒，将pCh-IHNV-G重组质粒线性化，用电穿孔技术将其导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻中，线性化pCh-IHNV-G与莱茵衣藻基因组随机重组，利用抗性筛选出转基因莱茵衣藻。Western Blot的分析结果表明，糖蛋白在莱茵衣藻中得到了表达，具有反应原性，本研究将转基因莱茵衣藻喂给小鼠，连续灌喂7 d后进行攻毒试验，应用流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化情况，结果显示，转基因莱茵衣藻可刺激小鼠体内T淋巴细胞的增值，从而有助于提高机体的免疫应答，证明了转基因莱茵衣藻具有一定的抗原性。

莱茵衣藻与螺旋藻相似可提高机体的免疫力，所以相应的灌喂莱茵衣藻的小鼠体内T淋巴细胞的数量也有所增加。但是转基因莱茵衣藻对提高机体的免疫应答方面更具有优势，其优势主要体现在外源蛋白的表达上面。樊振川等[13]阐述了莱茵衣藻作为绿色细胞工厂生产重组蛋白的研究，表明利用莱茵衣藻叶绿体基因组和核基因组已成功表达了多种重组蛋白,如蛋白亚基疫苗、单链抗体、蛋白细胞因子、蛋白类激素和工业养殖业用酶等,初步证实了莱茵衣藻作为绿色细胞工厂方面的实用性。Beltran-Lopez 等[14]在莱茵衣藻叶绿体基因组中成功表达了口服嵌合蛋白 CTB p210。Dauvillée 等[15]成功地融合了AMA1 和 MSP1两种临床相关的疟疾抗原，并将其结合到宿主细胞中的淀粉基质蛋白-淀粉合酶颗粒上。转化进入莱茵衣藻核基因组中，随后在叶绿体中进行淀粉颗粒转化。小鼠通过口服和腹腔注射两种方法用转基因淀粉颗粒进行免疫，两组均显示疟原虫显著减少，小鼠寿命有所增加。Sun等[16]将口蹄疫病毒抗原VPl与霍乱毒素B亚基(CTB)融合，重组到衣藻叶绿体表达载体中并且成功表达，融合蛋白CTBVP1显示出一定的生物活性，证明了莱茵衣藻可以用来生产口服疫苗，并产生黏膜免疫。针对IHNV造成幼鱼死亡率极高，而且鱼类的主要免疫途径为黏膜免疫，我们将IHNV的主要抗原糖蛋白在莱茵衣藻中得到了表达，为进一步研制口服IHNV疫苗奠定基础。

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