H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选

胡晓苗 ， 张丹俊 ， 戴 银 ， 赵瑞宏 ， 潘孝成 ， 周学利 ， 侯宏艳 ， 沈学怀 ， 朱传明

(安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 安徽 合肥 230031)

在我国，H9N2亚型禽流感病毒疫苗大部分还在使用,一些早期的分离株，例如华南地区使用的Ck/GD/SS/1994疫苗株，山东地区使用的Ck/SD/6/96疫苗株以及华东地区使用的SH/F/98疫苗株。疫苗的大规模使用对禽流感的防控确实发挥了重要作用，然而疫苗免疫压力的存在却加速了AIV的变异[1-4]。安徽地区近些年间H9N2亚型禽流感的监测数据表明，当前流行的H9N2病毒在遗传进化和抗原性分析方面均发生了比较显著的变化，其中HA基因遗传进化分支已演变为以Y280亚系占绝对优势。此外，HA蛋白一些关键位点氨基酸残基、糖基化位点、受体结合位点也均有不同程度的突变，现有疫苗株的保护效果亟需进一步评价[5-6]。这提示我们，应该尽快筛选新的H9N2疫苗株用于研制新型疫苗，以应对已出现变异的H9N2亚型禽流感的防控。

1 材料与方法

1.1 试剂 禽流感抗H9亚型标准阳性血清及抗原，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 毒株 经过HA基因遗传进化分析，选取12株近年来流行的H9亚型AIV，Dk/HK/Y280/97-like病毒亚系高度同源[5-6]，均为本实验室分离鉴定、保存。

1.3 实验动物和鸡胚 SPF种蛋，购自山东省家禽研究所SPF种鸡场，在本实验室孵化至9-11日龄鸡胚使用；SPF鸡由上述鸡胚继续孵化至出雏，饲养于实验室动物房中至10日龄。

1.4 病毒增殖能力的测定 按照现行《中国兽药典》附录对近3年分离的12株H9亚型AIV接种鸡胚后收集的尿囊液的病毒含量进行测定。将尿囊液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，尿囊腔内接种于10日龄SPF鸡胚，测定各鸡胚尿囊液的凝集效价。根据尿囊液HA测定结果按Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量(EID50)[7]。

1.5 病毒的纯化 选择HA效价较高(HA>29)的4株病毒，分别进行5轮有限稀释纯化(10-5-10-9)，将纯化好的上述病毒尿囊液分别按10-5稀释后，接种9～11日龄SPF鸡胚(0.2 mL)15枚，置37 ℃孵化72 h，去除死亡胚，所有活胚4 ℃放置5 h。收集72 h后活胚的尿囊液，取血凝价大于9 log2的鸡胚尿囊液，分装成小份，置-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.6 免疫血清的制备 将纯化好的尿囊液按常规方法制备油乳剂灭活疫苗[8]，颈部皮下接种6周龄SPF鸡，每次免疫0.3 mL/只，于首免后2周加强免疫1次，0.5 mL/只，于二免后21 d采血，分离血清，分别保存备用。

1.7 交叉HI试验 用制备的免疫血清与近年来流行代表毒株进行交叉HI试验[9-10]，根据结果将筛选出的最优秀毒株按常规方法制备油乳剂灭活疫苗。

1.8 免疫攻毒保护试验 14日龄SPF鸡120只，分成三组，其中两组各40只分别经颈背侧皮下注射商品化F/98疫苗和候选株灭活疫苗，另一组40只为对照组。21 d采血后，若HI效价稳定，且在8以上，各试验组40只鸡用选定4个流行毒株(CK/AH/35/15，CK/AH/416/15、CK/AH/36/14、CK/AH/AJ3/15各1株)攻毒，每个毒株攻5只，滴鼻点眼，每只攻毒量约为2×106EID50。观察攻毒后鸡群健康状况，并于攻毒后第5天采集所有试验鸡的泄殖腔及咽拭子进行病毒分离。每个棉拭样品处理后接种10日龄SPF鸡胚2枚，每24 h照胚1次，观察120 h后，所有接种的鸡胚均进行鸡胚尿囊液HA效价测定。对病毒感染为阴性的鸡胚，盲传1代，再次测定HA效价。分析不同毒株灭活疫苗对不同毒株攻击的交叉保护情况。

2 结果

2.1 病毒增殖能力的测定 病毒HA效价检测结果显示，12株病毒的血凝效价从27-11不等。EID50的检测结果显示，12株病毒的EID50为108.00-109.00/100 μL，见表1。

表1 H9N2亚型AIV分离株HA和EID50测定

2.2 病毒纯化结果 选择HA效价较高的4株病毒倍比稀释成10-5-10-9的稀释度，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，0.1 mL/枚，置35 ℃孵箱孵化96 h，弃去24 h内的死胚。然后分别收集尿囊液，测定其血凝价，取有血凝价的最高稀释度的鸡胚尿囊液继续做下一轮稀释纯化，连续纯化3轮，记录每一代纯化后的EID50，表2可知，纯化后的毒株EID50相差不大，证明原始病毒是比较纯的，达到预期效果。

表2 H9N2 AIVs分离株EID50的测定结果

2.3 交叉HI试验结果 以4株毒株免疫SPF鸡后分离的血清与这4株毒株、F98株一起进行交叉血凝抑制试验。结果显示，CK/AH/AJ3/15毒株免疫后产生的抗体与5种检测抗原反应的血凝抑制价均值在9.70-10.60之间，而其他3株毒株免疫SPF鸡后，诱导机体产生的抗体不管是针对自身抗原还是其他抗原，平均抗体水平分布在7.10-9.70之间。说明CK/AH/AJ3/15株病毒具有很好的免疫原性，可作为疫苗候选株。

表3 H9N2亚型AIV分离株的交叉HI抗体效价测定

2.4 免疫攻毒保护试验 分别免疫CK/AH/AJ3/15毒株灭活苗和商品化F/98疫苗试验鸡各一组，第三组做对照，在抗体效价达到8 log2后，以106EID50的剂量经静脉注射进行4种毒株和F98株攻毒。从攻毒后的第2天开始，攻毒对照组的鸡出现了不同程度的发病症状，发病的程度从轻度的精神沉郁到羽毛凌乱不等，免疫组鸡在攻毒后整体精神状态良好。

攻毒后第5天采集所有鸡的泄殖腔和气管棉拭接种10日龄SPF胚，测定排毒情况，结果见表4。对照组除攻CK/AH/35/15毒株的小组有1只鸡泄殖腔不排毒，其余全部排毒，对照组结果有效。免疫候选株CK/AH/AJ3/15油苗组对4种病毒有很好的保护效果，除了攻CK/AH/416/15病毒的小组有1只鸡的泄殖腔排毒，气管不排毒，其他小组鸡都不排毒，总的保护率为97.5%。而免疫F/98疫苗除了攻CK/AH/36/14病毒小组鸡泄殖腔、气管都不

表4 交叉免疫攻毒保护结果

C:泄殖腔cloaca ; T:气管trachea

排毒外，攻其他病毒的小组都有鸡只排毒，F/98疫苗总的保护率为85%。可以很明显的看出，候选疫苗株比商品化F/98疫苗保护效果更好。

3 讨论

3.1 禽流感病毒具有频繁变异的特点，包括H9N2亚型病毒也不列外。变异频繁，当前流行的H9N2病毒在抗原性上发生了较大变化。而养殖生产上使用的H9N2疫苗Ck/SH/F/98等疫苗株至今已有10多年的历史，免疫保护效果不如从前，已不能满足养殖生产的需要。在这一背景下，开展禽流感H9N2亚型新疫苗的研制正当其时。本试验在对近年来流行的H9N2病毒遗传进化分析的基础上，通过对12株分离的H9N2禽流感病毒的免疫原性和部分生物学特性的测定，初步认为CK/AH/AJ3/15病毒株可以作为新型H9N2禽流感亚型疫苗研制候选株。

3.2 禽流感病毒是分节段的负链单股RNA病毒,在复制过程中很容易发生基因突变及基因重组, 因而决定了其易变的特点，这也是禽流感疫苗免疫保护率跟不上病毒变异的主要原因。疫苗的基因同源性和抗原性差异是影响疫苗免疫效果的关键因素。姜北宇[11]研究发现，4种不同毒株灭活疫苗的抗原液的HA价差异很大, 最高为9 log2, 最低为5 log2,但其病毒含量(EID50)基本相同,制备出的4种灭活疫苗所诱导产生的HI抗体效价也基本相同。这些观点提示我们，必须从病毒滴度、抗原性和交叉免疫保护作用等方面筛选疫苗候选株。

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